A digestão por enzimas de restrição é uma técnica usada para cortar o DNA em locais específicos e predeterminados. As enzimas de restrição — também chamadas de endonucleases de restrição — são tesouras moleculares que reconhecem sequências curtas e palindrômicas de DNA e clivam o DNA nesses locais ou próximo a eles.
Como Funciona a Digestão por Enzimas de Restrição
- Escolha da Enzima
Cada enzima de restrição reconhece uma sequência específica de DNA, tipicamente de 4 a 8 pares de bases. Exemplos comuns incluem EcoRI (GAATTC) e HindIII (AAGCTT). Os cientistas escolhem as enzimas com base em onde elas cortam em relação à região de DNA de interesse.
- Preparação da Reação
O DNA purificado é misturado com a enzima de restrição, um tampão específico para aquela enzima e água. O tampão fornece a concentração de sal e o pH ideais para a enzima funcionar. A mistura é incubada na temperatura ótima da enzima, geralmente 37°C.
- Incubação
Durante a incubação, a enzima varre o DNA em busca de sua sequência de reconhecimento. Ao encontrar uma correspondência, ela corta o esqueleto do DNA em locais precisos. Se o DNA contiver múltiplos sítios de reconhecimento, ele será cortado em múltiplos fragmentos de tamanhos variados.
- Inativação por Calor
Após tempo de incubação suficiente, a reação é frequentemente aquecida a 65–80°C para desnaturar e inativar a enzima, interrompendo a digestão. Os fragmentos de DNA resultantes podem então ser analisados por eletroforese em gel de agarose ou usados em aplicações posteriores como clonagem.
