A ligação e clonagem de DNA é um conjunto de técnicas usadas para unir fragmentos de DNA e inseri-los em um vetor — uma molécula de DNA carreadora — para replicação dentro de um organismo hospedeiro, tipicamente bactérias. Isso permite que os cientistas produzam grandes quantidades de uma sequência específica de DNA.
Como Funciona a Ligação e Clonagem de DNA
- Preparação do Insert e do Vetor
Tanto o fragmento de DNA de interesse (o insert) quanto o vetor (geralmente um plasmídeo) são cortados com as mesmas enzimas de restrição. Isso cria pontas coesivas complementares — pequenas extremidades de fita simples que podem parear-se entre si.
- Ligação
O insert e o vetor cortados são misturados com DNA ligase, uma enzima que sela o esqueleto de açúcar-fosfato do DNA. As pontas coesivas complementares se alinham, e a ligase forma ligações covalentes, unindo permanentemente o insert ao vetor.
- Transformação
O plasmídeo ligado é introduzido em células bacterianas competentes através de um processo chamado transformação. Isso é frequentemente alcançado por choque térmico ou eletroporação, que torna a membrana bacteriana temporariamente permeável ao DNA.
- Seleção
As bactérias transformadas são plaqueadas em ágar contendo um antibiótico. O plasmídeo carrega um gene de resistência a antibióticos, então apenas as bactérias que incorporaram o plasmídeo sobrevivem. Isso cria colônias, cada uma descendente de uma única célula contendo o DNA clonado.
- Triagem
As colônias são triadas por PCR de colônia ou digestão por restrição para confirmar que contêm o insert correto. Colônias positivas são cultivadas em cultura líquida para produzir grandes quantidades do plasmídeo desejado.
