O ensaio imunoenzimático (ELISA) é um imunoensaio baseado em placa usado para detectar e quantificar proteínas, anticorpos, hormônios e outras moléculas específicas. Ele combina a especificidade de anticorpos com a sensibilidade da detecção baseada em enzimas.
Como funciona o ELISA
- Revestimento
Uma placa de microtitulação é revestida com um antígeno ou anticorpo de captura. A molécula alvo se liga à superfície por meio de adsorção passiva. A placa é incubada durante a noite e depois lavada para remover o material não ligado.
- Bloqueio
Uma solução de bloqueio contendo uma proteína irrelevante, como BSA ou caseína, é adicionada aos poços. Isto cobre quaisquer locais de ligação restantes na superfície da placa, evitando ligações não específicas nas etapas subsequentes.
- Anticorpo de detecção
Um anticorpo de detecção conjugado a uma enzima – mais comumente peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP) – é adicionado. Num ELISA sanduíche, um anticorpo primário liga-se ao alvo e um anticorpo secundário ligado a uma enzima liga-se ao primário.
- Geração de Sinal
Um substrato para a enzima é adicionado. A enzima converte o substrato em um produto colorido, fluorescente ou luminescente. A reação é deixada prosseguir por um tempo definido e então interrompida.
- Medição
O sinal é medido usando um leitor de placas. A intensidade do sinal é proporcional à quantidade de molécula alvo na amostra. Uma curva padrão utilizando concentrações conhecidas permite a quantificação.
- Formatos ELISA
- ELISA direto: o antígeno é revestido e um anticorpo ligado a uma enzima o detecta diretamente.
- ELISA indireto: o antígeno é revestido, um anticorpo primário se liga e um anticorpo secundário ligado a uma enzima o detecta.
- ELISA sanduíche: Um anticorpo de captura é revestido, o antígeno se liga e um anticorpo de detecção completa o sanduíche.
- ELISA competitivo: O sinal diminui à medida que a concentração alvo aumenta.
Protocolo Prático Sandwich ELISA
Cubra uma placa de microtitulação de alta ligação de 96 poços com 100 μL/poço de anticorpo de captura diluído em tampão de revestimento (tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M pH 9,6) em uma concentração de 1–5 μg/mL. Incubar durante a noite a 4°C. Lave a placa 3 vezes com 300 μL/poço de PBST (PBS + 0,05% Tween-20) usando uma lavadora de placas ou uma pipeta multicanal. Bloqueie cada poço com 200 μL de tampão de bloqueio (PBST contendo 3% de BSA ou 5% de leite em pó desnatado) por 1 hora em temperatura ambiente. Lave 3 vezes. Adicione 100 μL/poço de padrões (diluições em série da proteína alvo, normalmente 7 concentrações variando de 1000 pg/mL a 15 pg/mL) e amostras, cada uma em duplicata. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lave 5 vezes. Adicione 100 μL/poço de anticorpo de detecção (biotinilado ou diretamente conjugado com enzima) na concentração otimizada (normalmente 0,5–2 μg/mL). Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave 5 vezes. Se estiver usando um anticorpo de detecção biotinilado (ver sistemas biotina-avidina), adicione 100 μL/poço de estreptavidina-HRP (1:2000) por 30 minutos e lave 5 vezes. Adicione 100 μL/poço de solução de substrato TMB e incube no escuro por 15–30 minutos. Pare a reação com 50 μL/poço de H2SO4 2N. Meça a absorvância a 450 nm com um leitor de placas dentro de 30 minutos. Gere uma curva padrão traçando a absorvância versus concentração logarítmica e ajuste um modelo logístico de 4 parâmetros (4PL) ou logístico de 5 parâmetros. Calcule as concentrações da amostra interpolando a partir da curva padrão. As curvas aceitáveis têm um R² > 0,98 e concentrações padrão retrocalculadas entre 70–130% dos valores esperados.
Aplicação no mundo real
Um ELISA sanduíche para TNFα humano no soro do paciente utiliza um anticorpo de captura monoclonal e um anticorpo de detecção policlonal. O ensaio tem uma faixa de detecção de 15–1000 pg/mL com um limite de quantificação de 20 pg/mL. O soro de pacientes com artrite reumatóide mostra níveis de TNFα de 85 ± 32 pg/mL (n = 24) em comparação com 12 ± 7 pg/mL em controles saudáveis, confirmando o TNFα como um biomarcador de inflamação e apoiando as decisões de terapia anti-TNFα.
