A enzimohistoquímica é o estudo da atividade enzimática em seções de tecido. Diferentemente da imuno-histoquímica, que detecta a presença de proteína enzimática (ativa ou inativa), a enzimohistoquímica detecta a atividade funcional — a capacidade da enzima de catalisar sua reação específica. Esta informação funcional é frequentemente mais relevante para estados de doença do que a simples presença da proteína.
Princípios
A enzimohistoquímica depende de uma reação de captura na qual o produto da reação catalisada pela enzima é precipitado no local da atividade. Uma seção de tecido é incubada em uma solução de substrato contendo o substrato específico da enzima e um reagente de captura. A enzima converte o substrato; o produto da reação é capturado pelo reagente para formar um precipitado colorido insolúvel visível ao microscópio de luz.
A reação deve ser: específica (a enzima deve ser a única que pode usar o substrato nas condições utilizadas); o produto deve ser insolúvel (para permanecer no local da atividade); e o precipitado deve ser visível (colorido, fluorescente ou eletrodenso para localização ultraestrutural).
Fixação e Preservação da Atividade Enzimática
A fixação é a variável mais crítica na enzimohistoquímica. A formalina e outros fixadores de reticulação inibem a maioria das enzimas — o grau de inibição depende do tempo de fixação, temperatura e da enzima específica. A fixação breve (2-4 horas em formalina fria ou formol-cálcio) preserva alguma atividade enzimática enquanto mantém morfologia adequada. Seções congeladas não fixadas (seções de criostato de tecido congelado rapidamente) fornecem a maior atividade enzimática mas morfologia inferior.
Fixação a frio (4°C) reduz a inativação enzimática. Fixação com acetona (4°C, 30-60 minutos) preserva muitas enzimas melhor que a formalina. Sem fixação — seções congeladas frescas podem ser usadas para enzimas que são completamente inativadas por qualquer fixador. A pós-fixacão (incubar a seção para a reação enzimática primeiro, depois fixar) é uma abordagem alternativa.
Métodos de Detecção
Captura simultânea — a reação enzimática e a precipitação de captura ocorrem ao mesmo tempo. O substrato e o reagente de captura são misturados no meio de incubação. A maioria das hidrolases (fosfatase ácida, fosfatase alcalina, esterases) é demonstrada por captura simultânea usando um sal de diazônio como reagente de captura.
Acoplamento pós-incubação — a reação enzimática cria um produto de reação primário que é então acoplado a um reagente de captura em uma segunda etapa. Este método é usado para enzimas onde o produto primário é instável ou onde o reagente de captura interfere com a atividade enzimática.
Métodos de sais metálicos — o produto da reação enzimática (ex., fosfato da atividade da fosfatase) é capturado por um íon metálico (chumbo, cobalto, cobre) para formar um sal metálico insolúvel e eletrodenso. Esses métodos são compatíveis com microscopia de luz e eletrônica.
Métodos de sais de tetrazólio — usados para desidrogenases e oxidorredutases. A enzima transfere elétrons para NAD(P) ou FAD, que então reduz um sal de tetrazólio a um precipitado de formazana colorido e insolúvel. Diferentes sais de tetrazólio (NBT, MTT, INT) produzem formazanas de diferentes cores (azul, púrpura, vermelho).
Controles
Os controles são essenciais para validar as reações enzimohistoquímicas. Controle positivo — um tecido conhecido por conter a enzima (fígado para a maioria das enzimas metabólicas, rim para fosfatases, músculo esquelético para desidrogenases). Controle negativo — o mesmo tecido incubado sem substrato, com um inibidor enzimático específico ou com enzima inativada por calor (seção fervida). Controles de inibição usando inibidores enzimáticos específicos (ex., fluoreto de sódio para fosfatase ácida) confirmam que a reação é devida à enzima alvo e não a uma enzima de reação cruzada.
Aplicações
A enzimohistoquímica é usada em patologia muscular (tipagem de fibras musculares por reações de ATPase e NADH-TR — essencial para diagnosticar miopatias), patologia hepática (deficiências enzimáticas em doença hepática metabólica), patologia renal (padrões enzimáticos em lesão tubular) e patologia tumoral (fosfatase alcalina em osteossarcoma, esterase não específica em tumores histiocíticos). Embora a IHQ tenha substituído muitas aplicações da enzimohistoquímica, a enzimohistoquímica permanece insubstituível para demonstrar atividade enzimática funcional, particularmente no diagnóstico de doenças musculares e metabólicas. A garantia de qualidade inclui validação regular da atividade enzimática usando controles positivos e negativos.
