A extração e purificação de proteínas são técnicas essenciais para isolar uma proteína específica de uma mistura complexa de componentes celulares. As proteínas purificadas são necessárias para estudos estruturais, ensaios enzimáticos, produção de anticorpos e aplicações terapêuticas.
Como funciona a extração e purificação de proteínas
- Lise Celular
O primeiro passo é abrir as células para liberar seu conteúdo. Isto é feito por métodos mecânicos, tais como homogeneização, sonicação ou batimento de esferas, muitas vezes na presença de um tampão de lise contendo inibidores de protease para evitar a degradação de proteínas.
- Esclarecimento
O lisado é centrifugado para sedimentar detritos insolúveis, incluindo membranas celulares e organelas. O sobrenadante, contendo as proteínas solúveis, é recolhido. Este lisado clarificado é o material de partida para purificação.
- Precipitação ou Fracionamento
Às vezes é usada uma etapa inicial de enriquecimento. A precipitação com sulfato de amônio precipita seletivamente proteínas com base em sua solubilidade. A centrifugação diferencial pode separar proteínas por tamanho em um gradiente de densidade.
- Cromatografia
O método de purificação mais poderoso é a cromatografia em coluna, que separa proteínas com base em diferentes propriedades:
- Cromatografia de afinidade: Um ligante ou anticorpo específico na coluna liga-se à proteína alvo.
- Cromatografia de troca iônica: As proteínas são separadas por sua carga líquida.
- Cromatografia de exclusão de tamanho: As proteínas são separadas por seu tamanho e forma.
- Eluição e Coleta
A proteína alvo é liberada da coluna alterando as condições do tampão – alterando a concentração de sal, o pH ou adicionando um ligante concorrente. A proteína purificada é coletada em frações e analisada quanto à pureza.
- Controle de qualidade
A proteína purificada é analisada por SDS-PAGE ou eletroforese em gel capilar (CGE) para verificar seu tamanho e pureza. Western blotting confirma sua identidade. A concentração é medida utilizando um ensaio de quantificação de proteínas.
Extração prática de proteínas e protocolo de purificação His-Tag
Colha células (1 × 10⁷ células de mamíferos ou 50 mL de cultura bacteriana) por centrifugação a 500 × g por 5 minutos. Lave a pelota com PBS gelado. Ressuspender em 500 μL de tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) recentemente suplementado com 1 × coquetel inibidor de protease e 1 mM PMSF. Para células bacterianas que expressam uma proteína marcada com His, use um tampão de lise desnaturante (ureia 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0) ou tampão nativo (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM pH 8,0). Lisar células por sonicação em gelo: 3 pulsos de 15 segundos com amplitude de 30% com intervalos de resfriamento de 30 segundos. Centrifugar a 15.000 × g por 30 minutos a 4°C e coletar o sobrenadante. Equilibre 1 mL de resina de agarose Ni-NTA em uma coluna de gravidade com 10 volumes de coluna de tampão de ligação. Aplique o lisado clarificado e colete o fluxo. Lave com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem (tampão de ligação com imidazol 20–50 mM). Eluir a proteína marcada com His em frações de 5 × 1 mL usando tampão de eluição (tampão de ligação com imidazol 250 mM). Analise 20 μL de cada fração (lisado, fluxo, lavagem, eluições) por SDS-PAGE de 12%. Mancha com Coomassie Blue para visualizar a proteína alvo, uma única banda no peso molecular esperado nas frações de eluição indica uma purificação bem-sucedida. Para maior pureza, reunir as frações de eluição e correr em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200) equilibrada com tampão de armazenamento (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol).
Aplicação no mundo real
Uma quinase humana marcada com 6×His (MAPK14/p38α, 41 kDa) é expressa em E. coli BL21(DE3) com indução de IPTG 0,5 mM durante 4 horas a 30°C. Após a purificação do Ni-NTA, o SDS-PAGE mostra uma banda proeminente de 41 kDa nas frações de eluição com >90% de pureza. A proteína é concentrada a 5 mg/mL, congelada rapidamente em nitrogênio líquido e retém >80% da atividade quinase em um ensaio de fosforilação.
