蛋白质提取与纯化是从复杂的细胞组分混合物中分离特定蛋白质的基本技术。纯化的蛋白质用于结构研究、酶活性测定、抗体生产和治疗应用。

蛋白质提取与纯化的工作原理

1. 细胞裂解

第一步是破碎细胞以释放其内容物。通过机械方法如匀浆、超声破碎或珠磨进行，通常在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中进行，以防止蛋白质降解。

2. 澄清

裂解液离心以沉淀不溶性碎片，包括细胞膜和细胞器。收集含有可溶性蛋白质的上清液。该澄清的裂解液是纯化的起始材料。

3. 沉淀或分级分离

有时使用初步富集步骤。硫酸铵沉淀根据溶解度选择性沉淀蛋白质。差速离心可以在密度梯度中按大小分离蛋白质。

4. 层析

最强大的纯化方法是柱层析，它根据不同的性质分离蛋白质：

• 亲和层析：柱上的特异性配体或抗体结合目标蛋白质。
• 离子交换层析：蛋白质根据净电荷分离。
• 大小排阻层析：蛋白质根据大小和形状分离。

5. 洗脱与收集

通过改变缓冲液条件——改变盐浓度、pH或添加竞争性配体——将目标蛋白质从柱上释放。收集纯化的蛋白质组分并分析纯度。

6. 质量控制

通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质以检查其大小和纯度。Western blotting确认其身份。使用蛋白质定量测定法测量浓度。