A quantificação de proteínas é o processo de determinação da concentração de proteínas em uma solução. A quantificação precisa de proteínas é essencial para muitas aplicações posteriores, incluindo SDS-PAGE, Western blotting, ensaios enzimáticos e estudos estruturais.
Métodos comuns de quantificação de proteínas
Ensaio de Bradford
O ensaio de Bradford é baseado na ligação do corante Coomassie Brilliant Blue G-250 às proteínas. O corante muda de marrom para azul quando ligado à proteína, com a absorvância máxima variando de 465 nm a 595 nm. O ensaio é rápido, simples e compatível com a maioria dos buffers. É menos preciso na presença de detergentes.
Ensaio BCA
O ensaio do ácido bicinconínico (BCA) baseia-se na redução de Cu2+ a Cu1+ por proteínas em meio alcalino. O BCA então quela o Cu1+, formando uma cor roxa que é absorvida a 562 nm. O ensaio BCA é mais tolerante a detergentes que o ensaio de Bradford, mas é menos compatível com agentes redutores.
Ensaio Lowry
O ensaio de Lowry combina a reação do biureto (quelação de cobre) com o reagente Folin-Ciocalteu, que reage com resíduos de tirosina e triptofano. Produz uma cor azul medida em 750 nm. É sensível, mas requer um tempo cuidadoso e é afetado por muitas substâncias interferentes.
Absorvância UV (A280)
As proteínas absorvem a luz UV a 280 nm devido aos resíduos de triptofano e tirosina. A absorvância a 280 nm fornece uma estimativa rápida e não destrutiva da concentração de proteína. É mais preciso para proteínas puras com coeficientes de extinção conhecidos.
Curva Padrão
Todos os ensaios colorimétricos requerem uma curva padrão. Diluições em série de um padrão de proteína conhecido, tipicamente albumina de soro bovino (BSA), são preparadas e medidas. A absorbância da amostra desconhecida é comparada com a curva padrão para calcular sua concentração.
Protocolos práticos de ensaio BCA e Bradford
Ensaio BCA: Prepare padrões de BSA por diluição em série no mesmo tampão das amostras, um intervalo típico é 25–2.000 µg/mL (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.000 µg/mL). Misture 25 μL de cada padrão ou amostra com 200 μL de reagente de trabalho BCA (proporção de 50:1 do reagente A para o reagente B) em uma placa de 96 poços. Incubar a 37°C por 30 minutos. Resfrie à temperatura ambiente e meça a absorbância a 562 nm. Ajuste uma curva padrão quadrática ou linear. O ensaio BCA é compatível com detergentes (SDS, Triton X-100) até 5%, mas é incompatível com agentes redutores (DTT, β-mercaptoetanol) > 1 mM. Ensaio Bradford: Prepare padrões na mesma faixa (25–1000 µg/mL). Misture 10 μL de padrão ou amostra com 200 μL de reagente de Bradford (coomassie G-250 corante em ácido fosfórico e metanol). Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. Medir a absorvância a 595 nm. O ensaio de Bradford é rápido (2 minutos) e compatível com agentes redutores e agentes quelantes (EDTA), mas é fortemente inibido por detergentes (>0,1% Triton X-100 ou SDS). Para ambos os ensaios, inclua espaços em branco apenas com buffer. Cada padrão e amostra devem ser analisados em duplicado ou triplicado. Descartar leituras com CV > 15%. Solucione problemas de fundo elevado diluindo ainda mais a amostra, trocando os ensaios (use Bradford se as amostras contiverem agentes redutores, use BCA se as amostras contiverem detergentes) ou realizando uma precipitação com TCA/acetona para remover substâncias interferentes.
Aplicação no mundo real
Ao quantificar o lisado proteico de células de mamíferos extraídas em tampão RIPA (contendo 1% de Triton X-100 e 0,1% de SDS), o ensaio BCA é preferido ao de Bradford. A curva padrão de 25–2000 µg/mL de BSA em tampão RIPA mostra R² = 0,996. O lisado desconhecido dá A562 = 0,45, correspondendo a 1250 µg/mL. Após a diluição, 20 µg são carregados por pista para SDS-PAGE ou para análise por [eletroforese em gel capilar](/guides/eletroforese em gel capilar).
