Die Agarosegelelektrophorese ist eine grundlegende Labortechnik zur Trennung von DNA-Fragmenten anhand ihrer Größe. Wenn Wissenschaftler DNA nach Restriktionsverdau, PCR oder Reinigung analysieren müssen, greifen sie zur Visualisierung der Ergebnisse auf die Gelelektrophorese zurück. Während Plattenagarose-Gele nach wie vor der Standard für die routinemäßige DNA-Analyse sind, bietet die Kapillargelelektrophorese (CGE) eine automatisierte Hochdurchsatzalternative mit laserinduzierter Fluoreszenzdetektion, die häufig bei der forensischen DNA-Profilierung und DNA-Sequenzierung eingesetzt wird.

Wie die Agarose-Gelelektrophorese funktioniert

Die Technik beruht auf der Tatsache, dass DNA negativ geladen ist und in Richtung einer positiven Elektrode wandert, wenn sie in ein elektrisches Feld gebracht wird.

1. Vorbereiten des Gels

Agarosepulver wird mit TAE- oder TBE-Puffer (typischerweise 1× TAE oder 0,5× TBE) gemischt und erhitzt, bis es sich auflöst. Die geschmolzene Agarose wird in eine Gießschale gegossen, in die ein Kamm eingesetzt ist, um Vertiefungen zu erzeugen. Beim Abkühlen verfestigt es sich zu einer porösen Gelmatrix.

2. Laden der Proben

Die DNA-Proben werden mit einem Glycerin enthaltenden Ladefarbstoff (um sie sinken zu lassen) und Tracking-Farbstoffen (zur Überwachung der Migration) gemischt. Die Proben werden in die Vertiefungen des Gels pipettiert. Eine DNA-Leiter – eine Mischung aus Fragmenten bekannter Größe – wird als Größenreferenz in die erste Vertiefung geladen.

3. Elektrophorese

An das Gel wird ein elektrischer Strom angelegt. Da die DNA negativ geladen ist, bewegen sich die Fragmente durch das Gel zur positiven Elektrode. Kleinere Fragmente bewegen sich leicht und schnell durch die Gelporen, während sich größere Fragmente langsamer bewegen. Im Laufe der Zeit teilen sich die Fragmente je nach Größe in verschiedene Bänder auf.

4. Visualisierung

Nach der Elektrophorese wird das Gel mit einem DNA-bindenden Farbstoff wie Ethidiumbromid oder SYBR Safe gefärbt. Unter UV-Licht fluoresziert der Farbstoff und legt die DNA-Banden frei. Durch den Vergleich der Positionen der Banden mit der DNA-Leiter können Wissenschaftler die Größe jedes Fragments bestimmen.

Praktisches Gelelektrophoreseprotokoll

Wählen Sie den Agarose-Prozentsatz basierend auf den erwarteten Fragmentgrößen aus: 0,7 % für 0,8–10 kb, 1,0 % für 0,5–5 kb, 1,5 % für 0,2–3 kb und 2,0 % für 0,1–1 kb. Wiegen Sie die entsprechende Menge Agarose ab (z. B. 1 g für ein 1 %iges Gel) und fügen Sie 100 ml 1× TAE-Puffer hinzu. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat – alle 30 Sekunden schwenken, um eine Überhitzung zu vermeiden. Auf ~60 °C abkühlen, 5 µL GelGreen oder Ethidiumbromid (10 mg/ml) hinzufügen, mischen und mit eingesetztem Kamm in eine Gießschale gießen. 20–30 Minuten aushärten lassen. Geben Sie das Gel in den mit 1× TAE gefüllten Elektrophoresetank. Mischen Sie 5 µL jeder DNA-Probe mit 1 µL 6× Loading Dye (enthält Glycerin und Bromphenolblau). Laden Sie das gesamte Volumen in eine Vertiefung. Laden Sie 5 µL einer 1-kb-Plus-DNA-Leiter in die erste und letzte Vertiefung. Laufen Sie mit 5–10 V/cm (gemessen als Abstand zwischen den Elektroden) – für ein 10 cm großes Gel sind 80–100 V typisch. Laufen lassen, bis die Bromphenolblau-Farbstofffront etwa zwei Drittel der Gellänge zurückgelegt hat (30–60 Minuten). Visualisieren Sie es mit einem UV-Transilluminator (302 nm für Ethidiumbromid, 470 nm für GelGreen) und fotografieren Sie es. Für nachgelagerte Anwendungen (Gelextraktion) verwenden Sie langwelliges UV-Licht (365 nm), um DNA-Schäden zu minimieren.

Reale Anwendung

Nach der PCR-Amplifikation eines 1,5-kb-Genfragments werden 5 µL des Produkts auf einem 1 %igen Agarosegel entlang einer 1-kb-Leiter laufen gelassen. Eine helle Einzelbande bei 1,5 kb bestätigt die erfolgreiche Amplifikation ohne Primer-Dimer oder unspezifische Produkte. Das Gel wird fotografiert und die Bande zur Reinigung und Klonierung unter UV-Licht ausgeschnitten.