Der Restriktionsenzymverdau ist eine Technik, mit der DNA an bestimmten, vorgegebenen Stellen geschnitten wird. Restriktionsenzyme – auch Restriktionsendonukleasen genannt – sind molekulare Scheren, die kurze, palindromische DNA-Sequenzen erkennen und die DNA an oder in der Nähe dieser Stellen spalten.

Wie die Verdauung mit Restriktionsenzymen funktioniert

1. Auswahl des Enzyms

Jedes Restriktionsenzym erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, die typischerweise 4–8 Basenpaare lang ist. Gängige Beispiele sind EcoRI (GAATTC) und HindIII (AAGCTT). Wissenschaftler wählen Enzyme danach aus, wo sie relativ zur interessierenden DNA-Region schneiden.

2. Einrichten der Reaktion

Die gereinigte DNA wird mit dem Restriktionsenzym, einem für dieses Enzym spezifischen Puffer und Wasser gemischt. Der Puffer sorgt für die optimale Salzkonzentration und den optimalen pH-Wert für die Funktion des Enzyms. Die Mischung wird bei der optimalen Temperatur des Enzyms, normalerweise 37 °C, inkubiert.

3. Inkubation

Während der Inkubation durchsucht das Enzym die DNA nach ihrer Erkennungssequenz. Sobald eine Übereinstimmung gefunden wird, wird das DNA-Rückgrat an bestimmten Stellen durchtrennt. Wenn die DNA mehrere Erkennungsstellen enthält, wird sie in mehrere Fragmente unterschiedlicher Größe zerschnitten.

4. Hitzeinaktivierung

Nach ausreichender Inkubationszeit wird die Reaktion häufig auf 65–80 °C erhitzt, um das Enzym zu denaturieren und zu inaktivieren und so die Verdauung zu stoppen. Die resultierenden DNA-Fragmente können dann durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert oder in nachgelagerten Anwendungen wie dem Klonen verwendet werden.

Praktisches Restriction Digest-Protokoll

Richten Sie eine 20–50-µL-Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein. Kombinieren Sie für einen einzelnen Verdau 1 µg DNA, 2 µL 10× Restriktionspuffer (wählen Sie den vom Hersteller empfohlenen Puffer), 10 U Restriktionsenzym (typischerweise 1 µL) und nukleasefreies Wasser bis zum Endvolumen. Vorsichtig durch Pipettieren mischen und 1 Stunde lang bei der optimalen Temperatur des Enzyms (normalerweise 37 °C) inkubieren. Verwenden Sie für Doppelverdaus einen Puffer, der mit beiden Enzymen kompatibel ist – die meisten Hersteller bieten eine Kompatibilitätstabelle an. Wenn kein einzelner Puffer mehr als 75 % Aktivität für beide Enzyme bietet, führen Sie aufeinanderfolgende Verdauungen durch: Zuerst mit dem Enzym, das weniger Salz benötigt, reinigen Sie die DNA, dann verdauen Sie mit dem zweiten Enzym. Fügen Sie immer eine Kontrollreaktion ohne Enzym hinzu, um zu bestätigen, dass die DNA nicht abgebaut wird. Nach der Inkubation 20 Minuten lang bei 65–80 °C hitzeinaktivieren (wenn das Enzym hitzelabil ist) oder die verdaute DNA mit einem Säulenreinigungskit reinigen. Analysieren Sie 5–10 µL mittels Agarosegelelektrophorese. Beheben Sie eine unvollständige Verdauung, indem Sie die Inkubationszeit auf 2–4 Stunden verlängern, nach 1 Stunde frisches Enzym hinzufügen oder 2–5 U pro µg DNA verwenden. Wenn es sich bei der DNA um ein Supercoiled-Plasmid handelt, kann die vollständige Linearisierung 2–3 Stunden dauern. Für genomische DNA 2–5 U pro µg verwenden und über Nacht inkubieren.

Reale Anwendung

Beim Klonieren eines menschlichen Gens (2 kb) in pUC19 werden sowohl das PCR-Produkt als auch der Vektor mit EcoRI und HindIII verdaut. Ein doppelter Verdau im CutSmart-Puffer ergibt kompatible klebrige Enden. Nach 1 Stunde bei 37 °C werden durch Gelreinigung der linearisierte Vektor (2,7 kb) und das Insert (2 kb) isoliert. Durch Ligation und Transformation in E. coli entstehen Kolonien, von denen laut Kolonie-PCR 80 % das richtige Insert enthalten.