Der Restriktionsenzymverdau ist eine Technik, mit der DNA an bestimmten, vorgegebenen Stellen geschnitten wird. Restriktionsenzyme – auch Restriktionsendonukleasen genannt – sind molekulare Scheren, die kurze, palindromische DNA-Sequenzen erkennen und die DNA an oder in der Nähe dieser Stellen spalten.
Wie die Verdauung mit Restriktionsenzymen funktioniert
- Auswahl des Enzyms
Jedes Restriktionsenzym erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, die typischerweise 4–8 Basenpaare lang ist. Gängige Beispiele sind EcoRI (GAATTC) und HindIII (AAGCTT). Wissenschaftler wählen Enzyme danach aus, wo sie relativ zur interessierenden DNA-Region schneiden.
- Einrichten der Reaktion
Die gereinigte DNA wird mit dem Restriktionsenzym, einem für dieses Enzym spezifischen Puffer und Wasser gemischt. Der Puffer sorgt für die optimale Salzkonzentration und den optimalen pH-Wert für die Funktion des Enzyms. Die Mischung wird bei der optimalen Temperatur des Enzyms, normalerweise 37 °C, inkubiert.
- Inkubation
Während der Inkubation durchsucht das Enzym die DNA nach ihrer Erkennungssequenz. Sobald eine Übereinstimmung gefunden wird, wird das DNA-Rückgrat an bestimmten Stellen durchtrennt. Wenn die DNA mehrere Erkennungsstellen enthält, wird sie in mehrere Fragmente unterschiedlicher Größe zerschnitten.
- Hitzeinaktivierung
Nach ausreichender Inkubationszeit wird die Reaktion häufig auf 65–80 °C erhitzt, um das Enzym zu denaturieren und zu inaktivieren und so die Verdauung zu stoppen. Die resultierenden DNA-Fragmente können dann durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert oder in nachgelagerten Anwendungen wie dem Klonen verwendet werden.
