Western Blotting (auch Protein-Immunblotting genannt) ist eine Labortechnik zum Nachweis eines bestimmten Proteins in einer komplexen biologischen Probe. Während SDS-PAGE Proteine nach Größe trennt, kann es Ihnen nicht sagen, welches Protein welches ist – viele verschiedene Proteine können das gleiche Gewicht haben. Western Blotting löst dieses Problem durch den Einsatz von Antikörpern, die wie wärmesuchende Raketen wirken und nur an das eine spezifische Protein binden, das ein Wissenschaftler untersuchen möchte.
Wie Western Blotting funktioniert
Nachdem die Proteine durch SDS-PAGE getrennt wurden, sind sie immer noch im fragilen Gel eingeschlossen. Beim Western Blot werden sie auf eine stabile Oberfläche gebracht, wo sie mithilfe von Antikörpern nachgewiesen werden.
- Übertragen
Die Proteine werden vom Polyacrylamidgel auf eine dünne, haltbare Membran (normalerweise Nitrozellulose oder PVDF) übertragen. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes senkrecht zum Gel werden die Proteine aus dem Gel gedrückt und haften fest an der Oberfläche der Membran, wodurch eine exakte Nachbildung des ursprünglichen Trennmusters entsteht.
- Blockieren
Die Membran ist sehr klebrig und fängt jedes Protein auf, mit dem sie in Berührung kommt. Um zu verhindern, dass Antikörper an den leeren Stellen der Membran haften bleiben (was zu einem unordentlichen, dunklen Hintergrund führen würde), wird die Membran mit einer „Blockierungslösung“ getränkt – häufig einer verdünnten Proteinmischung wie fettfreier Trockenmilch oder Rinderserumalbumin (BSA).
- Antikörper-Inkubation
Die Membran wird mit einem Primärantikörper behandelt, der nur das Zielprotein erkennt. Nach dem Abwaschen aller ungebundenen Primärantikörper wird ein Sekundärantikörper hinzugefügt. Dieser zweite Antikörper erkennt den ersten und ist normalerweise an ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden, der als Signal fungiert.
- Erkennung
Um die Ergebnisse zu sehen, wird ein chemisches Substrat hinzugefügt, das mit dem Enzym auf dem Sekundärantikörper reagiert und dabei Licht (Chemolumineszenz) oder einen farbigen Niederschlag erzeugt. Dadurch entsteht auf einem Stück Film oder einem digitalen Bild ein dunkler Streifen, der nicht nur die Größe des Proteins, sondern auch seine genaue Identität und die Menge davon bestätigt.
