El Western blot (también llamado inmunotransferencia de proteínas) es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una proteína específica en una muestra biológica compleja. Aunque la SDS-PAGE separa las proteínas por tamaño, no permite determinar cuál es cada una; muchas proteínas diferentes pueden tener el mismo peso. El Western Blot soluciona este problema mediante el uso de anticuerpos que actúan como misiles termodirigidos, uniéndose únicamente a la proteína específica que el científico desea estudiar.
Cómo funciona el Western Blot
Después de separar las proteínas mediante SDS-PAGE, aún permanecen atrapadas dentro del frágil gel. El Western Blot las traslada a una superficie resistente donde se detectan mediante anticuerpos.
- Transferencia
Las proteínas se trasladan del gel de poliacrilamida a una membrana delgada y resistente (generalmente de nitrocelulosa o PVDF). Aplicando un campo eléctrico perpendicular al gel, las proteínas son expulsadas y se adhieren firmemente a la superficie de la membrana, creando una réplica exacta del patrón de separación original.
- Bloqueo
La membrana es muy pegajosa y atrapará cualquier proteína que toque. Para evitar que los anticuerpos se adhieran a los espacios vacíos de la membrana (lo que crearía un fondo oscuro y desordenado), esta se sumerge en una solución de bloqueo, que suele ser una mezcla de proteínas diluidas, como leche descremada en polvo o albúmina de suero bovino (BSA).
- Incubación de anticuerpos
La membrana se trata con un anticuerpo primario diseñado para reconocer únicamente la proteína diana. Tras eliminar cualquier anticuerpo primario no unido, se añade un anticuerpo secundario. Este segundo anticuerpo reconoce al primero y suele estar unido a una enzima o un colorante fluorescente que actúa como señal.
- Detección
Para ver los resultados, se añade un sustrato químico que reacciona con la enzima del anticuerpo secundario, produciendo luz (quimioluminiscencia) o un depósito de color. Esto crea una banda oscura en una película o imagen digital, confirmando no solo el tamaño de la proteína, sino también su identidad exacta y la cantidad presente.
