Estime la diversidad teórica de una biblioteca de phage display a partir de datos de transformación, modele el enriquecimiento ronda por ronda durante el biopanning y calcule la concentración de partículas de fago a partir de la absorbancia UV. La diversidad de la biblioteca depende del número de transformantes independientes, la eficiencia de ligación y la relación vector-inserto. El enriquecimiento por panning está influenciado por el título de entrada, la concentración del blanco, la rigurosidad del lavado y la eficiencia de elución — las selecciones típicas requieren 3–5 rondas para enriquecer ligandos específicos de un fondo de fagos no ligantes. La concentración de partículas de fago se determina espectrofotométricamente a partir de la absorbancia corregida a 269 nm y 320 nm.
Acerca de las Bibliotecas de Phage Display y el Panning
El phage display vincula la proteína mostrada (fenotipo) con su ADN codificante (genotipo) dentro de una partícula de fago filamentoso. Las bibliotecas se caracterizan por su diversidad — el número de clones únicos. Una buena biblioteca de anticuerpos inmunes contiene típicamente 10^7–10^8 clones únicos, mientras que las bibliotecas sintéticas o vírgenes pueden alcanzar 10^9–10^11. El tamaño de la biblioteca está limitado por la eficiencia de transformación y el rendimiento de ligación.
El panning selecciona clones ligantes mediante rondas iterativas de exposición al blanco, lavado, elución y amplificación. Cada ronda enriquece progresivamente los ligandos de alta afinidad. El monitoreo del enriquecimiento mediante el seguimiento de los títulos de entrada y salida (o mediante ELISA de fagos policlonal) es esencial para determinar cuándo aislar clones individuales para su caracterización.
Acerca de la Cuantificación de Partículas de Fago
La concentración de partículas de fago se puede determinar espectrofotométricamente midiendo la absorbancia UV de una preparación de fago purificada a 269 nm y 320 nm. La corrección a 320 nm compensa la dispersión de luz por las partículas de fago. La absorbancia corregida (A269 − A320), multiplicada por el factor de dilución, da la densidad óptica de la preparación de fago. La concentración de viriones se calcula usando la fórmula:
Viriones/mL = (A269 − A320) × dilución × 6×10^16 / longitud del genoma (bases)
Este método requiere conocer la longitud del genoma del fago, incluyendo cualquier inserto. Para partículas de fagémido derivadas de M13, una longitud típica del genoma es de aproximadamente 6400 bases (vector + inserto). El valor predeterminado de 6407 bases corresponde al fago auxiliar M13KO7.
