A PCR digital (dPCR) é um refinamento da PCR convencional que fornece quantificação absoluta de ácidos nucleicos sem necessidade de curva padrão. A amostra é particionada em milhares de pequenas reações individuais e, após a amplificação, o número de partições positivas versus negativas é contado.
Como Funciona a PCR Digital
- Particionamento
A mistura de PCR contendo a amostra, primers, sonda e polimerase é dividida em milhares de partições de tamanho nanolítrico. Isso pode ser feito usando um chip com micropoços, gotículas em uma emulsão de óleo (PCR digital em gotículas) ou outros métodos. Cada partição contém zero ou pelo menos uma cópia do DNA alvo.
- Amplificação
A amostra particionada passa por ciclagem térmica padrão. Em cada partição, a PCR prossegue independentemente. Partições contendo DNA alvo produzem produto amplificado, enquanto partições vazias não produzem nada.
- Detecção de Ponto Final
Após a amplificação, cada partição é analisada quanto à fluorescência. Partições contendo DNA alvo amplificado são classificadas como positivas (fluorescentes), enquanto aquelas sem são classificadas como negativas. Nenhum ciclo de quantificação (Ct) é necessário — é simplesmente uma leitura sim-ou-não por partição.
- Estatística de Poisson
Como o particionamento é aleatório, algumas partições podem conter múltiplas cópias do alvo. A estatística de Poisson é usada para calcular o número absoluto de moléculas alvo na amostra original com base na proporção de partições negativas.
- Aplicações
A PCR digital é altamente precisa e é usada para quantificar mutações raras, detectar patógenos de baixa abundância, analisar variações no número de cópias e verificar resultados de NGS. É menos sensível a inibidores de PCR do que a qPCR e fornece quantificação absoluta sem padrões.
