La PCR digital (dPCR) es un refinamiento de la PCR convencional que proporciona cuantificación absoluta de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La muestra se divide en miles de pequeñas reacciones individuales, y después de la amplificación, se cuenta el número de particiones positivas frente a las negativas.
Cómo Funciona la PCR Digital
- Particionamiento
La mezcla de PCR que contiene la muestra, los cebadores, la sonda y la polimerasa se divide en miles de particiones de tamaño nanolítrico. Esto puede hacerse usando un chip con micropocillos, gotitas en una emulsión de aceite (PCR digital de gotas), u otros métodos. Cada partición contiene cero o al menos una copia del ADN diana.
- Amplificación
La muestra particionada se somete a ciclos térmicos estándar. En cada partición, la PCR procede de forma independiente. Las particiones que contienen ADN diana producen producto amplificado, mientras que las particiones vacías no producen ninguno.
- Detección de Punto Final
Después de la amplificación, cada partición se analiza para detectar fluorescencia. Las particiones que contienen ADN diana amplificado se marcan como positivas (fluorescentes), mientras que aquellas sin él se marcan como negativas. No se necesita un ciclo de cuantificación (Ct)—es simplemente una lectura de sí o no por partición.
- Estadística de Poisson
Dado que el particionamiento es aleatorio, algunas particiones pueden contener múltiples copias de la diana. Se utilizan estadísticas de Poisson para calcular el número absoluto de moléculas diana en la muestra original basándose en la proporción de particiones negativas.
- Aplicaciones
La PCR digital es altamente precisa y se utiliza para cuantificar mutaciones raras, detectar patógenos de baja abundancia, analizar variaciones en el número de copias y verificar resultados de NGS. Es menos sensible a los inhibidores de PCR que la qPCR y proporciona cuantificación absoluta sin estándares.
