EMSA e footprinting de DNA são métodos clássicos para estudar interações proteína-DNA. O EMSA detecta a ligação e mede a afinidade, enquanto o footprinting identifica os nucleotídeos específicos que são contatados pela proteína de ligação.

Ensaio de Mudança de Mobilidade Eletroforética

O EMSA, também chamado de ensaio de gel shift, baseia-se na observação de que complexos proteína-DNA migram mais lentamente através de um gel de poliacrilamida nativo do que o DNA livre, similarmente à eletroforese em gel de agarose. Uma sonda de DNA marcada radioativamente ou fluorescentemente contendo o suposto sítio de ligação é incubada com um extrato proteico ou proteína purificada. A mistura é separada por eletroforese em gel nativo. O DNA livre corre mais rápido, enquanto o DNA ligado à proteína é deslocado para uma posição mais alta no gel.

O EMSA é altamente sensível e pode detectar interações em misturas complexas. A especificidade é demonstrada por competição com DNA não marcado específico e inespecífico. Excesso de DNA específico não marcado elimina a banda deslocada, enquanto o competidor inespecífico não o faz. Ensaios de supershift usam anticorpos contra a proteína de ligação para retardar ainda mais o complexo, confirmando a identidade da proteína.

Afinidade de Ligação e Estequiometria

O EMSA pode medir a afinidade de ligação titulando a concentração de proteína e quantificando a fração de DNA ligado. A constante de dissociação de equilíbrio é determinada a partir da concentração de proteína na metade da ligação máxima. Múltiplas bandas deslocadas podem revelar diferentes complexos estequiométricos ou múltiplos sítios de ligação. A ligação cooperativa é detectada quando a curva de ligação é sigmoide em vez de hiperbólica.

Desenho de Sonda

Sondas de DNA para EMSA têm tipicamente 20 a 40 pares de base contendo o sítio de ligação. Sondas de fita dupla são preparadas por anelamento de oligonucleotídeos complementares e marcação terminal com fósforo-32 radioativo ou corantes fluorescentes. Sondas mais longas de várias centenas de pares de base podem ser usadas para mapear regiões cis-reguladoras. Sondas marcadas com biotina com detecção quimioluminescente, como usado no Southern blot, fornecem uma alternativa não radioativa.

Footprinting com DNase I

O footprinting com DNase I identifica os nucleotídeos específicos protegidos por uma proteína ligada. Um fragmento de DNA marcado em uma extremidade é incubado com a proteína de ligação e então parcialmente digerido com DNase I. A nuclease corta o DNA desprotegido estocasticamente, mas a região ligada à proteína é protegida da clivagem. Os produtos de digestão são separados por eletroforese em gel desnaturante juntamente com um escada de sequenciamento.

O padrão de proteção aparece como uma lacuna na escada de bandas, a footprint. Os limites da footprint definem o sítio de ligação da proteína com resolução de nucleotídeo. Sítios hipersensíveis, onde a DNase I corta com mais frequência, são frequentemente vistos nas bordas da footprint e indicam curvatura do DNA induzida pela ligação da proteína.

Footprinting com Radical Hidroxila

O footprinting com radical hidroxila usa o radical hidroxila altamente reativo para clivar o esqueleto do DNA em cada posição com pouco viés de sequência. O radical é gerado pela reação de Fenton usando ferro-EDTA, ascorbato e peróxido de hidrogênio. Como o radical é menor que a DNase I, o footprinting com radical hidroxila fornece maior resolução, detectando contatos em faces individuais de nucleotídeos. É particularmente útil para analisar a periodicidade de interações proteína-DNA ao longo de uma hélice de DNA.

Abordagens In Vivo

O footprinting in vivo usa agentes que modificam o DNA em células vivas. O dimetilsulfato metila resíduos de guanina que não estão protegidos por proteínas ligadas. Após o tratamento, o DNA é isolado, clivado nos sítios metilados e analisado por PCR mediado por ligação. A comparação de padrões in vivo e in vitro revela quais sítios de ligação estão ocupados na célula. Ensaios de acessibilidade da cromatina como DNase-seq e ATAC-seq fornecem visões genômicas da cromatina aberta, mas em resolução menor que o footprinting.

Aplicações

O EMSA é usado para confirmar sítios de ligação previstos de fatores de transcrição, caracterizar sítios de ligação mutantes, estudar interações cooperativas e monitorar a atividade de ligação durante a purificação. O footprinting identifica a sequência exata de DNA reconhecida por uma proteína e revela mudanças conformacionais induzidas pela ligação.

Limitações

O EMSA requer complexos relativamente estáveis que sobrevivam à eletroforese. Complexos que se dissociam rapidamente podem não ser detectados. A matriz do gel pode estabilizar interações fracas, mas também criar artefatos por efeitos de confinamento. Ambas as técnicas requerem sondas de DNA purificadas e não são adequadas para análise de alto rendimento. O EMSA quantitativo requer controle cuidadoso da atividade específica da sonda e da linearidade da detecção.