A espectroscopia de fluorescência é uma técnica analítica que mede a emissão de luz de moléculas após excitação por fótons. É altamente sensível (limites de detecção até pM), seletiva e amplamente usada em bioquímica, análise ambiental e ciência dos materiais.
Princípios da Fluorescência
Uma molécula absorve um fóton e é promovida do estado fundamental (S0) para um estado singleto excitado (S1 ou S2). A conversão interna relaxa rapidamente a molécula para o nível vibracional mais baixo de S1 (regra de Kasha). A fluorescência ocorre quando a molécula retorna a S0 emitindo um fóton, e a luz emitida tem um comprimento de onda maior (menor energia) que a luz absorvida, um fenômeno conhecido como deslocamento de Stokes. Esse deslocamento surge da perda de energia através de relaxação vibracional e reorganização do solvente, e um grande deslocamento de Stokes (20-100 nm) permite a separação da luz de excitação e emissão por filtros ou monocromadores. O diagrama de Jablonski ilustra esses processos fotoquímicos: absorção, conversão interna, fluorescência, cruzamento intersistema e fosforescência.
Parâmetros de Fluorescência
Os principais parâmetros de fluorescência incluem rendimento quântico, tempo de vida e intensidade. O rendimento quântico (Φ) é a razão entre fótons emitidos e fótons absorvidos (Φ = kemitido/kabsorvido), com valores variando de menos de 0,01 (fracamente fluorescente) a quase 1,0 (altamente fluorescente, ex.: fluoresceína em pH 9, Φ = 0,95). O tempo de vida (τ) é o tempo médio que uma molécula passa no estado excitado antes de emitir um fóton, tipicamente 1-10 ns para fluoróforos orgânicos. A intensidade de fluorescência segue I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ, onde ε é a absortividade molar, b é o caminho óptico e c é a concentração; em baixas concentrações, a intensidade é proporcional à concentração.
Fluoróforos
Os fluoróforos são categorizados como intrínsecos ou extrínsecos. Fluoróforos intrínsecos são moléculas fluorescentes naturalmente ocorrentes, como aminoácidos aromáticos (triptofano, λex ~280 nm, λem ~350 nm), NADH, flavinas e clorofila. Fluoróforos extrínsecos são corantes sintéticos adicionados a amostras não fluorescentes, incluindo fluoresceína (λex 494 nm, λem 518 nm), rodamina, cianinas (Cy3, Cy5) e a série Alexa Fluor. Pontos quânticos são nanocristais semicondutores com emissão ajustável pelo tamanho, excitação ampla, emissão estreita e alta fotoestabilidade.
Instrumentação
Um espectrômetro de fluorescência inclui uma fonte de luz como uma lâmpada de arco de xenônio (amplo espectro, 200-1000 nm) ou LEDs para medições de estado estacionário, e lasers pulsados ou LEDs para medições resolvidas no tempo. Um monocromador de excitação seleciona o comprimento de onda de excitação, e um monocromador duplo reduz a luz espúria para medições de alta sensibilidade. O compartimento de amostra usa uma cubeta de quartzo clara de quatro lados para geometria de detecção em ângulo reto, ou geometria de face frontal para amostras altamente absorventes ou dispersivas. Um monocromador de emissão varre o comprimento de onda de emissão enquanto um filtro passa-alta bloqueia a luz de excitação dispersa, e o detector é tipicamente um tubo fotomultiplicador (PMT) para alta sensibilidade ou um CCD para detecção multicanal.
Técnicas de Fluorescência
Várias técnicas especializadas de fluorescência existem. A fluorescência de estado estacionário mede a intensidade de emissão em um comprimento de onda de excitação fixo e é usada para determinação de concentração e caracterização espectral de emissão. A fluorescência resolvida no tempo mede o decaimento da fluorescência após um pulso curto de excitação e é usada para determinar tempos de vida de fluorescência, distinguir supressão dinâmica de estática e estudar dinâmica molecular. A Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET) envolve transferência de energia não radiativa de um fluoróforo doador para um aceitador dentro de 1-10 nm, com eficiência proporcional a 1/r6, tornando-a uma régua molecular para distâncias em proteínas e ácidos nucleicos. A polarização de fluorescência (anisotropia) mede a mobilidade rotacional de fluoróforos e é usada em estudos de ligação e imunoensaios.
Supressão
A supressão da fluorescência pode ocorrer através de dois mecanismos. A supressão dinâmica (colisional) ocorre quando um supressor como O2, I- ou acrilamida difunde e colide com o fluoróforo durante o estado excitado, descrita pela equação de Stern-Volmer: F0/F = 1 + KSV[Q]. A supressão estática ocorre quando o supressor forma um complexo não fluorescente no estado fundamental com o fluoróforo. Os dois mecanismos são distinguidos por medições de tempo de vida: a supressão dinâmica reduz o tempo de vida enquanto a supressão estática não.
Aplicações
A espectroscopia de fluorescência é usada para análise quantitativa de analitos fluorescentes em amostras farmacêuticas e ambientais, ensaios de atividade enzimática usando substratos fluorogênicos, sequenciamento de DNA e análise de microarranjos usando marcadores fluorescentes, imagem celular e citometria de fluxo usando anticorpos e corantes fluorescentes, e monitoramento ambiental de poluentes como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e substâncias húmicas.
