La espectroscopia de fluorescencia es una técnica analítica que mide la emisión de luz de moléculas después de la excitación por fotones. Es altamente sensible (límites de detección hasta pM), selectiva y ampliamente usada en bioquímica, análisis ambiental y ciencia de materiales.
Principios de la Fluorescencia
Una molécula absorbe un fotón y pasa del estado fundamental (S0) a un estado singlete excitado (S1 o S2). La conversión interna relaja rápidamente la molécula al nivel vibracional más bajo de S1 (regla de Kasha). La fluorescencia ocurre cuando la molécula regresa a S0 emitiendo un fotón, y la luz emitida tiene mayor longitud de onda (menor energía) que la luz absorbida, un fenómeno conocido como desplazamiento de Stokes. Este desplazamiento surge de la pérdida de energía por relajación vibracional y reorganización del disolvente, y un gran desplazamiento de Stokes (20-100 nm) permite separar la luz de excitación y emisión mediante filtros o monocromadores. El diagrama de Jablonski ilustra estos procesos fotofísicos: absorción, conversión interna, fluorescencia, cruce entre sistemas y fosforescencia.
Parámetros de Fluorescencia
Los parámetros clave de fluorescencia incluyen el rendimiento cuántico, el tiempo de vida y la intensidad. El rendimiento cuántico (Φ) es la relación de fotones emitidos a fotones absorbidos (Φ = kemitidos/kabsorbidos), con valores que van desde menos de 0,01 (débilmente fluorescente) hasta cerca de 1,0 (altamente fluorescente, como fluoresceína a pH 9, Φ = 0,95). El tiempo de vida (τ) es el tiempo promedio que una molécula pasa en el estado excitado antes de emitir un fotón, típicamente 1-10 ns para fluoróforos orgánicos. La intensidad de fluorescencia sigue I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ, donde ε es la absortividad molar, b es la longitud del camino y c es la concentración; a bajas concentraciones, la intensidad es proporcional a la concentración.
Fluoróforos
Los fluoróforos se clasifican como intrínsecos o extrínsecos. Los fluoróforos intrínsecos son moléculas fluorescentes naturales como aminoácidos aromáticos (triptófano, λex ~280 nm, λem ~350 nm), NADH, flavinas y clorofila. Los fluoróforos extrínsecos son colorantes sintéticos añadidos a muestras no fluorescentes, incluyendo fluoresceína (λex 494 nm, λem 518 nm), rodamina, colorantes de cianina (Cy3, Cy5) y la serie Alexa Fluor. Los puntos cuánticos son nanocristales semiconductores con emisión ajustable por tamaño, excitación amplia, emisión estrecha y alta fotoestabilidad.
Instrumentación
Un espectrómetro de fluorescencia incluye una fuente de luz como una lámpara de arco de xenón (espectro amplio, 200-1000 nm) o LED para mediciones de estado estacionario, y láseres pulsados o LED para mediciones resueltas en el tiempo. Un monocromador de excitación selecciona la longitud de onda de excitación, y un doble monocromador reduce la luz dispersa para mediciones de alta sensibilidad. El compartimento de muestra utiliza una cubeta de cuarzo de cuatro caras transparentes para geometría de detección en ángulo recto, o geometría frontal para muestras altamente absorbentes o dispersoras. Un monocromador de emisión escanea la longitud de onda de emisión mientras un filtro de paso largo bloquea la luz de excitación dispersada, y el detector es típicamente un tubo fotomultiplicador (PMT) para alta sensibilidad o un CCD para detección multicanal.
Técnicas de Fluorescencia
Existen varias técnicas especializadas de fluorescencia. La fluorescencia de estado estacionario mide la intensidad de emisión a una longitud de onda de excitación fija y se usa para determinación de concentración y caracterización espectral de emisión. La fluorescencia resuelta en el tiempo mide la caída de fluorescencia después de un pulso corto de excitación y se usa para determinar tiempos de vida de fluorescencia, distinguir el apagamiento dinámico del estático y estudiar dinámica molecular. La Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia (FRET) implica la transferencia de energía no radiativa desde un fluoróforo donante a un aceptor dentro de 1-10 nm, con eficiencia proporcional a 1/r6, lo que la convierte en una regla molecular para distancias en proteínas y ácidos nucleicos. La polarización de fluorescencia (anisotropía) mide la movilidad rotacional de fluoróforos y se usa en estudios de unión e inmunoensayos.
Apagamiento (Quenching)
El apagamiento de fluorescencia puede ocurrir mediante dos mecanismos. El apagamiento dinámico (colisional) ocurre cuando un apagador como O2, I- o acrilamida difunde y colisiona con el fluoróforo durante el estado excitado, descrito por la ecuación de Stern-Volmer: F0/F = 1 + KSV[Q]. El apagamiento estático ocurre cuando el apagador forma un complejo no fluorescente en estado fundamental con el fluoróforo. Los dos mecanismos se distinguen por mediciones de tiempo de vida: el apagamiento dinámico reduce el tiempo de vida mientras que el estático no.
Aplicaciones
La espectroscopia de fluorescencia se utiliza para el análisis cuantitativo de analitos fluorescentes en muestras farmacéuticas y ambientales; ensayos de actividad enzimática usando sustratos fluorogénicos; secuenciación de ADN y análisis de microarrays usando marcadores fluorescentes; imagen celular y citometría de flujo usando anticuerpos y colorantes fluorescentes; y monitoreo ambiental de contaminantes como hidrocarburos aromáticos policíclicos y sustancias húmicas.
