荧光光谱是一种分析技术，测量分子被光子激发后发出的光。它具有高灵敏度（检测限低至 pM）、选择性好，广泛应用于生物化学、环境分析和材料科学。

荧光原理

分子吸收光子后从基态（S0）跃迁到激发单重态（S1 或 S2）。内转换使分子迅速弛豫到 S1 的最低振动能级（卡莎规则）。荧光发生在分子通过发射光子返回 S0 时，发射光的波长比吸收光更长（能量更低），这种现象称为斯托克斯位移。该位移源于振动弛豫和溶剂重组的能量损失，大的斯托克斯位移（20-100 nm）允许通过滤光片或单色器分离激发光和发射光。雅布隆斯基图说明了这些光物理过程：吸收、内转换、荧光、系间窜越和磷光。

荧光参数

关键荧光参数包括量子产率、寿命和强度。量子产率（Φ）是发射光子数与吸收光子数之比（Φ = k发射/k吸收），数值范围从小于 0.01（弱荧光）到接近 1.0（强荧光，如荧光素在 pH 9 时 Φ = 0.95）。寿命（τ）是分子在发射光子前处于激发态的平均时间，有机荧光团通常为 1-10 ns。荧光强度遵循 I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ，其中 ε 是摩尔吸光系数，b 是光程，c 是浓度；在低浓度下，强度与浓度成正比。

荧光团

荧光团分为内源性和外源性两类。内源性荧光团是天然存在的荧光分子，如芳香族氨基酸（色氨酸，λex ~280 nm，λem ~350 nm）、NADH、黄素和叶绿素。外源性荧光团是添加到非荧光样品中的合成染料，包括荧光素（λex 494 nm，λem 518 nm）、罗丹明、花青染料（Cy3、Cy5）和 Alexa Fluor 系列。量子点是半导体纳米晶体，具有尺寸可调的发射光谱、宽激发、窄发射和高光稳定性。

仪器

荧光光谱仪包括光源，如氙弧灯（宽光谱，200-1000 nm）或 LED 用于稳态测量，脉冲激光或 LED 用于时间分辨测量。激发单色器选择激发波长，双单色器可减少杂散光以实现高灵敏度测量。样品室使用四侧透光的石英比色皿进行直角检测，或使用前表面几何用于高吸收或散射样品。发射单色器扫描发射波长，长通滤光片阻挡散射的激发光，检测器通常为光电倍增管（PMT）用于高灵敏度，或 CCD 用于多通道检测。

荧光技术

存在几种专门的荧光技术。稳态荧光在固定激发波长下测量发射强度，用于浓度测定和发射光谱表征。时间分辨荧光在短激发脉冲后测量荧光衰减，用于测定荧光寿命、区分动态猝灭和静态猝灭以及研究分子动力学。荧光共振能量转移（FRET）涉及从供体荧光团到受体（1-10 nm 内）的非辐射能量转移，效率与 1/r6 成正比，使其成为蛋白质和核酸中距离的分子尺。荧光偏振（各向异性）测量荧光团的旋转迁移率，用于结合研究和免疫分析。

猝灭

荧光猝灭可通过两种机制发生。动态（碰撞）猝灭发生在猝灭剂（如 O2、I- 或丙烯酰胺）在激发态期间扩散并与荧光团碰撞时，由 Stern-Volmer 方程描述：F0/F = 1 + KSV[Q]。静态猝灭发生在猝灭剂与荧光团形成不发荧光的基态络合物时。两种机制通过寿命测量区分：动态猝灭降低寿命，而静态猝灭不降低。

应用

荧光光谱用于药物和环境样品中荧光分析物的定量分析；使用荧光底物的酶活性测定；使用荧光标记的 DNA 测序和微阵列分析；使用荧光抗体和染料的细胞成像和流式细胞术；以及多环芳烃和腐殖质等污染物的环境监测。