O Northern Blotting é uma técnica laboratorial usada para detectar e quantificar moléculas específicas de RNA dentro de uma amostra biológica. Enquanto um Western blot analisa proteínas e um Southern blot analisa DNA, o Northern blot informa aos cientistas quais genes estão realmente “ligados” (expressos) em uma célula em um momento específico. Medindo a quantidade de RNA mensageiro (mRNA), os pesquisadores podem determinar se uma doença, um medicamento ou uma mudança ambiental está fazendo uma célula aumentar ou diminuir a produção de instruções específicas.
Como Funciona o Northern Blotting
O RNA é notoriamente frágil e propenso a ser degradado por enzimas chamadas RNases que estão em toda parte — até mesmo em seus dedos. Por causa disso, o processo requer extremo cuidado e condições “limpas”.
- Separação do RNA
O RNA total é extraído das células e separado por tamanho usando eletroforese em gel. Como o RNA é de fita simples, ele tende a se dobrar em formas complexas; para evitar isso, um agente “desnaturante” (como formaldeído) é adicionado ao gel para manter as moléculas de RNA lineares, de modo que se movam estritamente de acordo com seu comprimento.
- Transferência
Assim como em um Western blot, as fitas de RNA separadas são transferidas do gel frágil para uma membrana resistente de nylon ou nitrocelulose. Isso é frequentemente feito por ação capilar, onde uma pilha de papel toalha “absorve” o tampão SSC (solução salina-citrato de sódio) através do gel e da membrana, puxando o RNA junto e prendendo-o na superfície da membrana.
- Hibridização
A membrana é exposta a uma sonda — um pequeno pedaço de DNA ou RNA de fita simples que é complementar à sequência alvo. Esta sonda é “marcada” com um átomo radioativo ou um corante fluorescente. A sonda varre a membrana e se liga (hibridiza) apenas ao seu parceiro de RNA correspondente, ignorando todo o resto do RNA “ruído”.
- Detecção
Após lavar as sondas não ligadas, a membrana é colocada contra um filme de raio-X ou escaneada com um imageador digital. As sondas marcadas criam bandas escuras ou linhas brilhantes. A espessura e intensidade da banda informam ao cientista exatamente quanto daquele mRNA específico estava presente na amostra original.
