A PCR quantitativa (qPCR), também conhecida como PCR em tempo real, é uma técnica laboratorial que amplifica e quantifica simultaneamente o DNA em tempo real. Ao contrário do PCR convencional, que mostra apenas a quantidade final de DNA, o qPCR monitora o acúmulo de DNA ao longo da reação usando fluorescência.

Como funciona o qPCR

1. Configuração de reação

A reação contém os mesmos componentes da PCR convencional – DNA modelo, primers, DNA polimerase e nucleotídeos – além de um repórter fluorescente. Dois sistemas repórteres comuns são SYBR Green, um corante que apresenta fluorescência quando ligado a DNA de fita dupla, e sondas TaqMan, que são sondas fluorescentes específicas de sequência.

2. Amplificação e Detecção

A reação passa pelos mesmos ciclos térmicos da PCR padrão: desnaturação, recozimento e extensão. Após cada ciclo, é feita uma medição de fluorescência. À medida que mais DNA é amplificado, o sinal de fluorescência aumenta proporcionalmente.

3. O valor Ct

O ciclo limite (Ct) é o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência sobe acima do nível de fundo. O valor Ct é inversamente proporcional à quantidade inicial de DNA alvo: mais DNA inicial significa que menos ciclos são necessários para atingir o limite.

4. Quantificação

A quantificação absoluta utiliza uma curva padrão de concentrações conhecidas de DNA para calcular a quantidade exata de DNA alvo. A quantificação relativa compara os valores de Ct de um gene alvo com um gene de referência, determinando alterações na expressão.

5. Análise da curva de fusão

Quando o SYBR Green é usado, uma análise da curva de fusão é realizada após a amplificação. O DNA é aquecido lentamente enquanto a fluorescência é monitorada. Cada produto de DNA derrete a uma temperatura característica, confirmando que o amplicon correto foi produzido e que nenhum dímero de primer está presente.

Protocolo qPCR prático

Prepare a reação em uma placa de 96 ou 384 poços. Para SYBR Green, misture 5 μL de 2× SYBR Green master mix, 0,5 μL de cada primer (10 μM), 2 μL de modelo cDNA ou DNA e água até 10 μL. Para detecção baseada em sonda, substitua SYBR Green por uma mistura mestre de sonda 2× e adicione 0,2–0,4 µM de cada sonda. Selar a placa com filme adesivo óptico e centrifugar brevemente. Execute em um ciclador em tempo real com o seguinte programa: 95°C por 2 minutos (ativação da polimerase), depois 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 30–60 segundos (recozimento e extensão). Colete dados de fluorescência no final de cada etapa de extensão. Após o ciclo, execute uma rampa de curva de fusão de 60°C a 95°C se estiver usando SYBR Green. Para quantificação absoluta, prepare uma curva padrão diluindo em série um modelo conhecido (10^{7 a 10}2 cópias/μL em etapas de 10 vezes). Plote Ct vs. número de cópias logarítmicas e verifique se a inclinação está entre -3,1 e -3,6 (90–110% de eficiência). Para quantificação relativa usando o método ΔΔCq, calcule ΔCt = Ct(alvo) − Ct(referência), então ΔΔCt = ΔCt(tratado) − ΔCt(controle). Mudança de dobra = 2^(−ΔΔCt). Inclui controles sem modelo e controles sem RT para alvos baseados em RNA. Execute todas as amostras em triplicatas técnicas e descarte qualquer uma com desvio padrão Ct > 0,5.

Aplicação no mundo real

Em estudos de expressão gênica para pesquisa do câncer, o RT-qPCR com SYBR Green quantifica os níveis de mRNA de oncogenes como MYC e supressores de tumor como TP53. GAPDH ou ACTB serve como gene de referência. O RNA do tumor e do tecido normal adjacente é transcrito reversamente, e a análise ΔΔCq revela que o MYC é regulado positivamente 8,5 vezes nos tumores (p <0,001). A análise da curva de fusão confirma um único produto na Tm esperada, descartando artefatos de dímero de iniciador.