A PCR quantitativa (qPCR), também conhecida como PCR em tempo real, é uma técnica laboratorial que amplifica e quantifica simultaneamente o DNA em tempo real. Ao contrário da PCR convencional, que mostra apenas a quantidade final de DNA, a qPCR monitora o acúmulo de DNA durante toda a reação usando fluorescência.
Como Funciona a qPCR
- Configuração da Reação
A reação contém os mesmos componentes da PCR convencional — DNA molde, primers, DNA polimerase e nucleotídeos — mais um repórter fluorescente. Dois sistemas repórteres comuns são SYBR Green, um corante que fluoresce quando ligado ao DNA de fita dupla, e sondas TaqMan, que são sondas fluorescentes específicas para a sequência.
- Amplificação e Detecção
A reação passa pela mesma ciclagem térmica da PCR padrão: desnaturação, anelamento e extensão. Após cada ciclo, uma medição de fluorescência é feita. À medida que mais DNA é amplificado, o sinal de fluorescência aumenta proporcionalmente.
- O Valor de Ct
O ciclo limiar (Ct) é o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência se eleva acima do nível de fundo. O valor de Ct é inversamente proporcional à quantidade inicial de DNA alvo: mais DNA inicial significa menos ciclos necessários para atingir o limiar.
- Quantificação
A quantificação absoluta usa uma curva padrão de concentrações conhecidas de DNA para calcular a quantidade exata de DNA alvo. A quantificação relativa compara os valores de Ct de um gene alvo a um gene de referência, determinando as mudanças na expressão (fold change).
- Análise da Curva de Melting
Quando o SYBR Green é usado, uma análise da curva de melting é realizada após a amplificação. O DNA é aquecido lentamente enquanto a fluorescência é monitorada. Cada produto de DNA derrete em uma temperatura característica, confirmando que o amplicon correto foi produzido e que não há dímeros de primers.
