La PCR cuantitativa (qPCR), también conocida como PCR en tiempo real, es una técnica de laboratorio que amplifica y cuantifica simultáneamente el ADN en tiempo real. A diferencia de la PCR convencional, que solo muestra la cantidad final de ADN, la qPCR monitorea la acumulación de ADN durante toda la reacción mediante fluorescencia.
Cómo funciona la qPCR
- Preparación de la reacción
La reacción contiene los mismos componentes que la PCR convencional—ADN molde, cebadores, ADN polimerasa y nucleótidos—más un reportero fluorescente. Dos sistemas de reportero comunes son SYBR Green, un colorante que fluorece cuando se une al ADN de doble cadena, y las sondas TaqMan, que son sondas fluorescentes específicas de secuencia.
- Amplificación y detección
La reacción se somete al mismo ciclo térmico que la PCR estándar: desnaturalización, alineamiento y extensión. Después de cada ciclo, se toma una medición de fluorescencia. A medida que se amplifica más ADN, la señal de fluorescencia aumenta proporcionalmente.
- El valor Ct
El ciclo umbral (Ct) es el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia supera el nivel de fondo. El valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad inicial de ADN diana: más ADN inicial significa que se necesitan menos ciclos para alcanzar el umbral.
- Cuantificación
La cuantificación absoluta utiliza una curva estándar de concentraciones conocidas de ADN para calcular la cantidad exacta de ADN diana. La cuantificación relativa compara los valores Ct de un gen diana con un gen de referencia, determinando los cambios en la expresión en forma de veces.
- Análisis de curva de melting
Cuando se utiliza SYBR Green, se realiza un análisis de curva de melting después de la amplificación. El ADN se calienta lentamente mientras se monitorea la fluorescencia. Cada producto de ADN se funde a una temperatura característica, confirmando que se produjo el amplicón correcto y que no hay dímeros de cebadores.
