A PCR de transcrição reversa (RT-PCR) é uma técnica usada para detectar e amplificar RNA. Ela combina duas etapas: transcrição reversa do RNA em DNA complementar (cDNA), seguida pela amplificação por PCR do cDNA. Isso permite que os cientistas estudem a expressão gênica e detectem vírus de RNA.
Como Funciona a RT-PCR
- Extração de RNA
O RNA total é extraído da amostra e tratado com DNase para remover qualquer DNA genômico contaminante. A qualidade e concentração do RNA são verificadas antes de prosseguir.
- Transcrição Reversa
O RNA é misturado com a enzima transcriptase reversa, primers aleatórios ou primers oligo-dT e nucleotídeos. A transcriptase reversa usa o RNA como molde para sintetizar uma fita de DNA complementar. O molde de RNA é então degradado pela RNase H, deixando cDNA de fita simples.
- Amplificação por PCR
O cDNA é então usado como molde para a PCR padrão com primers específicos para o gene. A PCR amplifica o cDNA, produzindo DNA suficiente para visualização em gel ou quantificação por qPCR.
- Detecção
Os produtos amplificados da PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose. A presença de uma banda no tamanho esperado confirma que o RNA alvo estava presente na amostra original.
- Aplicações
A RT-PCR é amplamente usada para medir níveis de expressão gênica, detectar vírus de RNA como HIV e SARS-CoV-2, validar dados de sequenciamento de RNA e analisar splicing alternativo. Quando combinada com qPCR, torna-se RT-qPCR, permitindo a quantificação em tempo real do RNA.
