La RT-PCR (PCR par transcription inverse) est une technique utilisée pour détecter et amplifier l’ARN. Elle combine deux étapes : la transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire (ADNc), suivie de l’amplification par PCR de l’ADNc. Cela permet aux scientifiques d’étudier l’expression génique et de détecter les virus à ARN.
Comment Fonctionne la RT-PCR
- Extraction de l’ARN
L’ARN total est extrait de l’échantillon et traité à la DNase pour éliminer tout ADN génomique contaminant. La qualité et la concentration de l’ARN sont vérifiées avant de procéder.
- Transcription Inverse
L’ARN est mélangé avec l’enzyme transcriptase inverse, des amorces aléatoires ou des amorces oligo-dT, et des nucléotides. La transcriptase inverse utilise l’ARN comme matrice pour synthétiser un brin d’ADN complémentaire. La matrice d’ARN est ensuite dégradée par la RNase H, laissant un ADNc simple brin.
- Amplification par PCR
L’ADNc est ensuite utilisé comme matrice pour une PCR standard avec des amorces spécifiques du gène. La PCR amplifie l’ADNc, produisant suffisamment d’ADN pour visualiser sur un gel ou quantifier par qPCR.
- Détection
Les produits de PCR amplifiés sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. La présence d’une bande à la taille attendue confirme que l’ARN cible était présent dans l’échantillon d’origine.
- Applications
La RT-PCR est largement utilisée pour mesurer les niveaux d’expression génique, détecter les virus à ARN tels que le VIH et le SARS-CoV-2, valider les données de séquençage d’ARN et analyser l’épissage alternatif. Lorsqu’elle est combinée à la qPCR, elle devient la RT-qPCR, permettant une quantification en temps réel de l’ARN.
