Visão geral
A montagem de sequência é o processo computacional de reconstrução de um genoma completo ou transcriptoma a partir de milhões ou bilhões de pequenos fragmentos de DNA produzidos por sequenciadores. Como as máquinas de sequenciamento leem apenas 150 a 300 pares de bases por vez, os algoritmos de montagem devem encontrar sobreposições entre as leituras, fundi-las em sequências contíguas mais longas (contigs) e ordenar os contigs em andaimes. A dificuldade de montagem aumenta com o tamanho do genoma, conteúdo repetitivo e heterozigosidade. A qualidade da montagem é medida por métricas como N50 (o comprimento do contig no qual 50% da montagem é coberta) e o número total de contigs.
Métodos
Existem dois paradigmas principais de montagem. Overlap-layout-consensus (OLC), usado por Canu e Flye para leituras longas, calcula todas as sobreposições de pares entre leituras, constrói um gráfico e resolve caminhos para produzir uma sequência de consenso. Os montadores de grafo De Bruijn, como SPAdes e Velvet, decompõem leituras em k-mers e constroem um gráfico onde k-mers são nós e as arestas representam k-1 sobreposições; esta abordagem é dimensionada de forma eficiente para grandes genomas com alta cobertura. Os montadores híbridos combinam a precisão das leituras curtas com as informações de longo alcance das leituras longas para resolver regiões repetitivas. Montadores metagenômicos como o MEGAHIT lidam com comunidades microbianas mistas, acomodando profundidades de cobertura variadas entre as espécies.
Aplicativos
A montagem do genoma de novo produz genomas de referência para organismos recentemente sequenciados, incluindo bactérias, plantas e vertebrados. Em projetos de sequenciamento de última geração, a montagem é a primeira etapa antes da anotação e da análise. A montagem do transcriptoma de sequenciamento de DNA lê revela isoformas com splicing alternativo. Tecnologia de DNA recombinante usa montagem para verificar construções de plasmídeo montando leituras de sequenciamento Sanger de inserções clonadas.
Protocolo Prático
Para montagem de sequenciamento Sanger usando Phred/Phrap/Consed, comece com arquivos de rastreamento ABI brutos (.ab1). A chamada de base com Phred converte rastreamentos em sequências de alta qualidade com índices de qualidade por base: phred -id seqs_dir -qd seqs_phd_dir -sd seqs_fasta_dir. Phred relata pontuações de qualidade na escala Phred (-10 × log₁₀(error_probability)), onde Q20 = 99% de precisão e Q30 = 99,9% de precisão. Monte leituras com Phrap: phrap seqs_fasta_dir/*.fasta -ace > assembly.log. Phrap usa um algoritmo Smith-Waterman em faixas com índices de qualidade para calcular sequências de consenso e montar leituras em contigs. Visualize e edite manualmente a montagem no Consed: consed -acephap ace_file. Consed exibe leituras alinhadas com codificação de cores de qualidade básica, destaca discrepâncias e permite a edição manual do consenso. Navegue até as áreas problemáticas sinalizadas pelo Phrap como discrepâncias de alta qualidade (barras vermelhas) ou regiões de baixa qualidade (destaques em azul). Resolva manualmente as discrepâncias examinando os cromatogramas de cada leitura, aparando extremidades de baixa qualidade e corrigindo bases erradas. Gere uma sequência de consenso final com qualidade verificada: Arquivo → Exportar Consenso. Para a montagem de novo de um pequeno genoma bacteriano a partir de leituras da Illumina, use SPAdes com o sinalizador --isolate para dados de cepa única. Avalie a integridade da montagem com QUAST calculando o conteúdo N50, L50 e GC. Para finalizar, solicite contigs usando CONTIGUADOR em relação a uma referência intimamente relacionada e, em seguida, feche as lacunas projetando primers nas extremidades contig para PCR e sequenciamento Sanger. Verifique a montagem final alinhando as leituras com BWA-MEM e verificando a uniformidade da cobertura.
