O sequenciamento de próxima geração (NGS) engloba um conjunto de tecnologias modernas de sequenciamento que podem sequenciar milhões de fragmentos de DNA em paralelo, tornando possível sequenciar genomas inteiros de forma rápida e acessível. Plataformas como Illumina, Ion Torrent e PacBio dominam o campo.
Como Funciona o NGS (Plataforma Illumina)
- Preparação da Biblioteca
O DNA é fragmentado em pequenos pedaços, tipicamente de 200–600 pares de bases. Adaptadores — sequências curtas conhecidas — são ligados a ambas as extremidades de cada fragmento. Estes adaptadores permitem que os fragmentos se liguem à flow cell e sirvam como locais de iniciação para o sequenciamento.
- Geração de Clusters
A biblioteca é carregada em uma flow cell cuja superfície é coberta com oligonucleotídeos complementares. Cada fragmento se liga à flow cell e sofre amplificação em ponte: o fragmento se dobra, uma nova fita é sintetizada e o processo se repete, criando um cluster de milhares de cópias idênticas de cada fragmento.
- Sequenciamento por Síntese
Nucleotídeos fluorescentemente marcados são passados sobre a flow cell um de cada vez. Cada nucleotídeo tem um terminador reversível que permite que apenas uma base seja adicionada por ciclo. Após cada ciclo, a fluorescência é imageada para identificar qual base foi adicionada a cada cluster.
- Análise de Dados
Milhões de leituras de sequenciamento são geradas. Estas leituras são alinhadas a um genoma de referência ou montadas de novo. Ferramentas de bioinformática identificam variantes genéticas, níveis de expressão gênica ou modificações epigenéticas, dependendo da aplicação.
- Aplicações
O NGS é usado para sequenciamento de genoma completo, painéis de genes direcionados, sequenciamento de RNA, análise epigenética e metagenômica, entre muitas outras aplicações.
