Next-Generation-Sequencing (NGS) umfasst eine Reihe moderner Sequenzierungstechnologien, die Millionen von DNA-Fragmenten parallel sequenzieren können und es so ermöglichen, ganze Genome schnell und kostengünstig zu sequenzieren. Plattformen wie Illumina, Ion Torrent und PacBio dominieren das Feld.
So funktioniert NGS (Illumina-Plattform)
- Vorbereitung der Bibliothek
Die DNA ist in kleine Stücke fragmentiert, typischerweise 200–600 Basenpaare. Adapter – kurze bekannte Sequenzen – werden an beide Enden jedes Fragments ligiert. Diese Adapter ermöglichen die Bindung der Fragmente an die Durchflusszelle und dienen als Priming-Sites für die Sequenzierung.
- Cluster-Generierung
Die Bibliothek wird auf eine Durchflusszelle geladen, deren Oberfläche mit komplementären Oligonukleotiden beschichtet ist. Jedes Fragment bindet an die Durchflusszelle und durchläuft eine Brückenverstärkung: Das Fragment biegt sich um, ein neuer Strang wird synthetisiert und der Vorgang wiederholt sich, wodurch ein Cluster aus Tausenden identischer Kopien jedes Fragments entsteht.
- Sequenzierung durch Synthese
Fluoreszierend markierte Nukleotide werden einzeln über die Durchflusszelle geleitet. Jedes Nukleotid verfügt über einen reversiblen Terminator, der das Hinzufügen nur einer Base pro Zyklus ermöglicht. Nach jedem Zyklus wird die Fluoreszenz abgebildet, um zu identifizieren, welche Base zu jedem Cluster hinzugefügt wurde.
- Datenanalyse
Es werden Millionen von Sequenzierungslesungen generiert. Diese Lesevorgänge werden an einem Referenzgenom ausgerichtet oder de novo zusammengesetzt. Bioinformatik-Tools identifizieren je nach Anwendung genetische Varianten, Genexpressionsniveaus oder epigenetische Modifikationen.
- Bewerbungen
NGS wird neben vielen anderen Anwendungen für die Sequenzierung des gesamten Genoms, gezielte Gen-Panels, RNA-Sequenzierung, epigenetische Analyse und Metagenomik verwendet.
