RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, die Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um den vollständigen Satz von RNA-Transkripten in einer Zell- oder Gewebeprobe zu analysieren. Es liefert eine Momentaufnahme der Genexpression und zeigt, welche Gene in welchem Ausmaß aktiv sind.
Wie RNA-Seq funktioniert
- RNA-Extraktion
Die Gesamt-RNA wird aus der Probe mit Methoden extrahiert, die der DNA-Isolierung ähneln, jedoch mit zusätzlichen Schritten zur Erhaltung der fragilen RNA-Moleküle. Die RNA-Integrität wird mittels Gelelektrophorese oder einem Bioanalysator überprüft.
- mRNA-Anreicherung oder rRNA-Depletion
Da ribosomale RNA den größten Teil der Gesamt-RNA ausmacht, wird sie entfernt, um sie an Boten-RNA (mRNA) anzureichern. Dies geschieht mithilfe von Poly-T-Kügelchen, die die Poly-A-Schwänze der mRNA einfangen, oder durch selektive Depletion ribosomaler RNA-Sequenzen.
- Vorbereitung der Bibliothek
Die angereicherte mRNA wird in kleine Stücke fragmentiert und mithilfe von Zufallsprimern revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Adapter werden an die cDNA-Fragmente ligiert und die Bibliothek wird durch PCR amplifiziert.
- Sequenzierung
Die cDNA-Bibliothek wird auf einer NGS-Plattform sequenziert und generiert Millionen kurzer Lesevorgänge. Jeder Lesevorgang stellt eine kurze Sequenz von einem Ende eines cDNA-Fragments dar.
- Datenanalyse
Die Lesevorgänge werden auf ein Referenzgenom oder -transkriptom ausgerichtet. Die Anzahl der Lesevorgänge, die jedem Gen zugeordnet sind, wird gezählt, um die Expressionsniveaus zu quantifizieren. Die differenzielle Expressionsanalyse identifiziert Gene, die zwischen verschiedenen Bedingungen deutlich hoch- oder herunterreguliert werden.
- Bewerbungen
RNA-Seq wird zur Untersuchung von Genexpressionsveränderungen bei Entwicklung, Krankheit, Arzneimittelbehandlung und Umweltreaktionen verwendet. Es kann auch alternatives Spleißen, neuartige Transkripte und nichtkodierende RNAs erkennen.
Praktisches RNA-Seq-Protokoll
Extrahieren Sie Gesamt-RNA mit TRIzol oder einer säulenbasierten Methode mit DNase-Behandlung auf der Säule. Bewerten Sie die RNA-Integrität auf einem Bioanalyzer oder einer TapeStation – für mRNA-Seq ist eine RNA-Integritätszahl (RIN) > 7 erforderlich, während für die gesamte RNA-Seq mit rRNA-Depletion ein Wert von > 5 ausreichen kann. Zur mRNA-Anreicherung inkubieren Sie 0,1–1 µg Gesamt-RNA mit Poly-T-Oligo-gebundenen Magnetkügelchen, um polyadenylierte mRNA einzufangen. Alternativ können Sie ein Ribo-Zero-Kit verwenden, um zytoplasmatische und mitochondriale rRNA zu dezimieren. Fragmentieren Sie die angereicherte mRNA durch 8-minütige Inkubation bei 94 °C in Fragmentierungspuffer, wodurch ~200 nt-Fragmente entstehen. Synthetisieren Sie Erststrang-cDNA mit Zufallshexameren und Reverse Transkriptase bei 25 °C für 10 Minuten, 42 °C für 50 Minuten und 70 °C für 15 Minuten. Ersetzen Sie den RNA-Strang während der Zweitstrangsynthese durch dUTP, um Strangspezifität zu ermöglichen – der zweite Strang, der dUTP enthält, wird während der Bibliotheksamplifikation selektiv abgebaut. Führen Sie die Endreparatur, das A-Tailing und die Adapterligatur wie bei der standardmäßigen NGS-Bibliotheksvorbereitung durch. Bauen Sie den dUTP-markierten zweiten Strang mit dem USER-Enzym vor der PCR-Anreicherung ab (10–15 Zyklen). Sequenzieren Sie die endgültige Bibliothek auf einer Illumina-Plattform und generieren Sie 20–40 Millionen Paired-End-Reads pro Probe (2 × 75 bp oder 2 × 150 bp). Verarbeiten Sie rohe FASTQ-Dateien über eine Bioinformatik-Pipeline: Qualitätstrimmung mit Cutadapt, Ausrichtung auf das Referenzgenom mit STAR (2-Pass-Modus für neuartige Spleißverbindungen), Quantifizierung der Anzahl auf Genebene mit featureCounts oder HTSeq und Identifizierung differenziell exprimierter Gene mit DESeq2 oder EdgeR unter Verwendung eines Schwellenwerts für die Falscherkennungsrate von 0,05. Um die statistische Aussagekraft zu gewährleisten, schließen Sie mindestens drei biologische Replikate pro Bedingung ein.
Reale Anwendung
In einer Studie, in der medikamentenbehandelte Hepatozyten mit Kontrollhepatozyten verglichen wurden, identifizierte RNA-Seq 1.247 unterschiedlich exprimierte Gene (FDR < 0,05). Die Analyse der Signalweganreicherung zeigt eine Hochregulierung der Gene des Lipidstoffwechsels und eine Herabregulierung der Entzündungswege. Die Daten werden durch RT-qPCR an 10 ausgewählten Genen validiert und bestätigen die Richtung und das Ausmaß der Faltungsänderungen.
