RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, die Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um den vollständigen Satz von RNA-Transkripten in einer Zell- oder Gewebeprobe zu analysieren. Es liefert eine Momentaufnahme der Genexpression und zeigt, welche Gene in welchem Ausmaß aktiv sind.
Wie RNA-Seq funktioniert
- RNA-Extraktion
Die Gesamt-RNA wird aus der Probe mit Methoden extrahiert, die der DNA-Isolierung ähneln, jedoch mit zusätzlichen Schritten zur Erhaltung der fragilen RNA-Moleküle. Die RNA-Integrität wird mittels Gelelektrophorese oder einem Bioanalysator überprüft.
- mRNA-Anreicherung oder rRNA-Depletion
Da ribosomale RNA den größten Teil der Gesamt-RNA ausmacht, wird sie entfernt, um sie an Boten-RNA (mRNA) anzureichern. Dies geschieht mithilfe von Poly-T-Kügelchen, die die Poly-A-Schwänze der mRNA einfangen, oder durch selektive Depletion ribosomaler RNA-Sequenzen.
- Vorbereitung der Bibliothek
Die angereicherte mRNA wird in kleine Stücke fragmentiert und mithilfe von Zufallsprimern revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Adapter werden an die cDNA-Fragmente ligiert und die Bibliothek wird durch PCR amplifiziert.
- Sequenzierung
Die cDNA-Bibliothek wird auf einer NGS-Plattform sequenziert und generiert Millionen kurzer Lesevorgänge. Jeder Lesevorgang stellt eine kurze Sequenz von einem Ende eines cDNA-Fragments dar.
- Datenanalyse
Die Lesevorgänge werden auf ein Referenzgenom oder -transkriptom ausgerichtet. Die Anzahl der Lesevorgänge, die jedem Gen zugeordnet sind, wird gezählt, um die Expressionsniveaus zu quantifizieren. Die differenzielle Expressionsanalyse identifiziert Gene, die zwischen verschiedenen Bedingungen deutlich hoch- oder runterreguliert werden.
- Bewerbungen
RNA-Seq wird zur Untersuchung von Genexpressionsveränderungen bei Entwicklung, Krankheit, Arzneimittelbehandlung und Umweltreaktionen verwendet. Es kann auch alternatives Spleißen, neuartige Transkripte und nichtkodierende RNAs erkennen.
