O sequenciamento de RNA (RNA-Seq) é uma técnica que usa o sequenciamento de próxima geração para analisar o conjunto completo de transcritos de RNA em uma amostra de célula ou tecido. Ele fornece um instantâneo da expressão gênica, revelando quais genes estão ativos e em quais níveis.
Como Funciona o RNA-Seq
- Extração de RNA
O RNA total é extraído da amostra usando métodos semelhantes ao isolamento de DNA, mas com etapas adicionais para preservar as frágeis moléculas de RNA. A integridade do RNA é verificada usando eletroforese em gel ou um bioanalisador.
- Enriquecimento de mRNA ou Depleção de rRNA
Como o RNA ribossômico constitui a maior parte do RNA total, ele é removido para enriquecer o RNA mensageiro (mRNA). Isso é feito usando beads de poli-T que capturam as caudas poli-A do mRNA, ou depletando seletivamente as sequências de RNA ribossômico.
- Preparação da Biblioteca
O mRNA enriquecido é fragmentado em pequenos pedaços e transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA) usando primers aleatórios. Adaptadores são ligados aos fragmentos de cDNA, e a biblioteca é amplificada por PCR.
- Sequenciamento
A biblioteca de cDNA é sequenciada em uma plataforma de NGS, gerando milhões de leituras curtas. Cada leitura representa uma sequência curta de uma extremidade de um fragmento de cDNA.
- Análise de Dados
As leituras são alinhadas a um genoma ou transcriptoma de referência. O número de leituras mapeadas para cada gene é contado para quantificar os níveis de expressão. A análise de expressão diferencial identifica genes que estão significativamente regulados positiva ou negativamente entre condições.
- Aplicações
O RNA-Seq é usado para estudar mudanças na expressão gênica no desenvolvimento, doenças, tratamento medicamentoso e respostas ambientais. Também pode detectar splicing alternativo, novos transcritos e RNAs não codificantes.
