Le séquençage de l’ARN (RNA-Seq) est une technique qui utilise le séquençage de nouvelle génération pour analyser l’ensemble complet des transcrits d’ARN dans un échantillon cellulaire ou tissulaire. Il fournit un instantané de l’expression génique, révélant quels gènes sont actifs et à quels niveaux.
Comment Fonctionne le RNA-Seq
- Extraction de l’ARN
L’ARN total est extrait de l’échantillon en utilisant des méthodes similaires à l’isolation de l’ADN, mais avec des étapes supplémentaires pour préserver les fragiles molécules d’ARN. L’intégrité de l’ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel ou bioanalyseur.
- Enrichissement de l’ARNm ou Déplétion de l’ARNr
Comme l’ARN ribosomal constitue la majeure partie de l’ARN total, il est éliminé pour enrichir l’ARN messager (ARNm). Cela se fait en utilisant des billes poly-T qui capturent les queues poly-A de l’ARNm, ou en déplétant sélectivement les séquences d’ARN ribosomal.
- Préparation de la Banque
L’ARNm enrichi est fragmenté en petits morceaux et rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) en utilisant des amorces aléatoires. Des adaptateurs sont ligaturés aux fragments d’ADNc, et la banque est amplifiée par PCR.
- Séquençage
La banque d’ADNc est séquencée sur une plateforme NGS, générant des millions de courtes lectures. Chaque lecture représente une courte séquence d’une extrémité d’un fragment d’ADNc.
- Analyse des Données
Les lectures sont alignées sur un génome ou transcriptome de référence. Le nombre de lectures correspondant à chaque gène est compté pour quantifier les niveaux d’expression. L’analyse d’expression différentielle identifie les gènes significativement sous- ou surexprimés entre les conditions.
- Applications
Le RNA-Seq est utilisé pour étudier les changements d’expression génique dans le développement, la maladie, le traitement médicamenteux et les réponses environnementales. Il peut également détecter l’épissage alternatif, les nouveaux transcrits et les ARN non codants.
