Estime a diversidade teórica de uma biblioteca de phage display a partir de dados de transformação, modele o enriquecimento rodada por rodada durante o biopanning e calcule a concentração de partículas de fago a partir da absorbância UV. A diversidade da biblioteca depende do número de transformantes independentes, da eficiência de ligação e da razão vetor-inserção. O enriquecimento por panning é influenciado pelo título de entrada, concentração do alvo, rigor da lavagem e eficiência de eluição — seleções típicas requerem 3–5 rodadas para enriquecer ligantes específicos de um fundo de fagos não ligantes. A concentração de partículas de fago é determinada espectrofotometricamente a partir da absorbância corrigida a 269 nm e 320 nm.
Sobre Bibliotecas de Phage Display e Panning
O phage display liga a proteína exibida (fenótipo) ao seu DNA codificante (genótipo) dentro de uma partícula de fago filamentoso. As bibliotecas são caracterizadas por sua diversidade — o número de clones únicos. Uma boa biblioteca de anticorpos imunes contém tipicamente 10^7–10^8 clones únicos, enquanto bibliotecas sintéticas ou ingênuas podem atingir 10^9–10^11. O tamanho da biblioteca é limitado pela eficiência de transformação e pelo rendimento da ligação.
O panning seleciona clones ligantes através de rodadas iterativas de exposição ao alvo, lavagem, eluição e amplificação. Cada rodada enriquece progressivamente ligantes de alta afinidade. O monitoramento do enriquecimento pelo acompanhamento dos títulos de entrada e saída (ou por ELISA de fagos policlonal) é essencial para determinar quando isolar clones individuais para caracterização.
Sobre a Quantificação de Partículas de Fago
A concentração de partículas de fago pode ser determinada espectrofotometricamente medindo a absorbância UV de uma preparação de fago purificada a 269 nm e 320 nm. A correção a 320 nm compensa o espalhamento de luz pelas partículas de fago. A absorbância corrigida (A269 − A320), multiplicada pelo fator de diluição, fornece a densidade óptica da preparação de fago. A concentração de vírions é então calculada usando a fórmula:
Vírions/mL = (A269 − A320) × diluição × 6×10^16 / comprimento do genoma (bases)
Este método requer conhecimento do comprimento do genoma do fago, incluindo qualquer inserto. Para partículas de fagemídeo derivadas de M13, um comprimento típico de genoma é de aproximadamente 6400 bases (vetor + inserto). O valor padrão de 6407 bases corresponde ao fago auxiliar M13KO7.
