Die digitale PCR (dPCR) ist eine Weiterentwicklung der herkömmlichen PCR, die eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren ermöglicht, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist. Die Probe wird in Tausende winziger Einzelreaktionen aufgeteilt und nach der Amplifikation wird die Anzahl der positiven gegenüber den negativen Teilungen gezählt.
So funktioniert die digitale PCR
- Partitionierung
Das PCR-Gemisch, das Probe, Primer, Sonde und Polymerase enthält, wird in Tausende von Partitionen in Nanolitergröße aufgeteilt. Dies kann mithilfe eines Chips mit Mikrovertiefungen, Tröpfchen in einer Ölemulsion (Tropfen-Digital-PCR) oder anderen Methoden erfolgen. Jede Partition enthält entweder null oder mindestens eine Kopie der Ziel-DNA.
- Verstärkung
Die aufgeteilte Probe wird einem standardmäßigen thermischen Wechsel unterzogen. In jeder Partition läuft die PCR unabhängig ab. Partitionen, die Ziel-DNA enthalten, produzieren amplifiziertes Produkt, während leere Partitionen keines produzieren.
- Endpunkterkennung
Nach der Amplifikation wird jede Partition auf Fluoreszenz analysiert. Partitionen, die amplifizierte Ziel-DNA enthalten, werden als positiv (fluoreszierend) bewertet, während Partitionen ohne amplifizierte Ziel-DNA als negativ bewertet werden. Es ist kein Quantifizierungszyklus (Ct) erforderlich – es handelt sich lediglich um eine Ja-oder-Nein-Auslesung pro Partition.
- Poisson-Statistik
Da die Partitionierung zufällig erfolgt, können einige Partitionen mehrere Kopien des Ziels enthalten. Mithilfe der Poisson-Statistik wird die absolute Anzahl der Zielmoleküle in der Originalprobe basierend auf dem Anteil negativer Partitionen berechnet.
- Bewerbungen
Die digitale PCR ist hochpräzise und wird zur Quantifizierung seltener Mutationen, zum Nachweis von Krankheitserregern mit geringer Häufigkeit, zur Analyse von Variationen der Kopienzahl und zur Überprüfung der NGS-Ergebnisse verwendet. Es ist weniger empfindlich gegenüber PCR-Inhibitoren als qPCR und bietet eine absolute Quantifizierung ohne Standards.
Praktischer dPCR-Workflow
Bereiten Sie den PCR-Mastermix vor, der die Proben-DNA (1–100 ng), Primer, Sonde und Tröpfchenerzeugungsöl enthält. Für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) laden Sie die Mischung in einen Tröpfchengenerator, der die Probe in etwa 20.000 gleichmäßige Nanoliter-Tröpfchen in einer Wasser-in-Öl-Emulsion aufteilt. Bei der Chip-basierten dPCR wird die Probe in einen Mikrofluidik-Chip mit vorgefertigten Mikrovertiefungen (typischerweise etwa 20.000 Vertiefungen) geladen. Übertragen Sie die aufgeteilte Probe in einen Thermocycler und verstärken Sie sie unter Standard-Cycling-Bedingungen bis zum Endpunkt. Lesen Sie nach der Verstärkung die Fluoreszenz jeder Partition mit einem speziellen Lesegerät ab. Partitionen mit Ziel-DNA zeigen eine Fluoreszenz oberhalb eines manuell eingestellten Schwellenwerts und werden als positiv bewertet. Wenden Sie die Poisson-Statistik an: λ = −ln(1 − p) wobei p der Anteil der positiven Partitionen ist; Die absolute Zielkonzentration (Kopien/µL) ist λ dividiert durch das Partitionsvolumen. Verwenden Sie für eine zuverlässige Quantifizierung mindestens 10.000 akzeptierte Partitionen. Fügen Sie eine Kontrolle ohne Vorlage und eine Positivkontrolle mit bekannter Kopiennummer hinzu. Für den Nachweis seltener Mutationen verwenden Sie zwei Fluoreszenzsonden – eine mit FAM markierte Wildtyp-Sonde und eine mit HEX markierte Mutantensonde –, um Mutanten- und Wildtyp-Moleküle in derselben Reaktion zu unterscheiden.
Reale Anwendung
Bei der Flüssigbiopsie zur Krebsüberwachung erkennt ddPCR zirkulierende Tumor-DNA-Mutationen (ctDNA) wie EGFR T790M bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Aus dem Blut wird Plasma-DNA (10 ng) extrahiert und mit mutationsspezifischen Sonden analysiert. ddPCR löst mutierte Allelfrequenzen von nur 0,01 % auf, was weit unter der Nachweisgrenze der Sanger-Sequenzierung liegt. Die absolute Kopienzahl mutierter Moleküle pro ml Plasma wird berechnet, was eine Längsverfolgung der Tumorlast und eine frühzeitige Erkennung von Behandlungsresistenzen ermöglicht.
