Die digitale PCR (dPCR) ist eine Weiterentwicklung der herkömmlichen PCR, die eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren ermöglicht, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist. Die Probe wird in Tausende winziger Einzelreaktionen aufgeteilt und nach der Amplifikation wird die Anzahl der positiven gegenüber den negativen Teilungen gezählt.
So funktioniert die digitale PCR
- Partitionierung
Das PCR-Gemisch, das Probe, Primer, Sonde und Polymerase enthält, wird in Tausende von Partitionen in Nanolitergröße aufgeteilt. Dies kann mithilfe eines Chips mit Mikrovertiefungen, Tröpfchen in einer Ölemulsion (Tropfen-Digital-PCR) oder anderen Methoden erfolgen. Jede Partition enthält entweder null oder mindestens eine Kopie der Ziel-DNA.
- Verstärkung
Die aufgeteilte Probe wird einem standardmäßigen thermischen Wechsel unterzogen. In jeder Partition läuft die PCR unabhängig ab. Partitionen, die Ziel-DNA enthalten, produzieren amplifiziertes Produkt, während leere Partitionen keines produzieren.
- Endpunkterkennung
Nach der Amplifikation wird jede Partition auf Fluoreszenz analysiert. Partitionen, die amplifizierte Ziel-DNA enthalten, werden als positiv (fluoreszierend) bewertet, während Partitionen ohne amplifizierte Ziel-DNA als negativ bewertet werden. Es ist kein Quantifizierungszyklus (Ct) erforderlich – es handelt sich lediglich um eine Ja-oder-Nein-Auslesung pro Partition.
- Poisson-Statistik
Da die Partitionierung zufällig erfolgt, können einige Partitionen mehrere Kopien des Ziels enthalten. Mithilfe der Poisson-Statistik wird die absolute Anzahl der Zielmoleküle in der Originalprobe basierend auf dem Anteil negativer Partitionen berechnet.
- Bewerbungen
Die digitale PCR ist hochpräzise und wird zur Quantifizierung seltener Mutationen, zum Nachweis von Krankheitserregern mit geringer Häufigkeit, zur Analyse von Variationen der Kopienzahl und zur Überprüfung der NGS-Ergebnisse verwendet. Es ist weniger empfindlich gegenüber PCR-Inhibitoren als qPCR und bietet eine absolute Quantifizierung ohne Standards.
