CRISPR/Cas9 es una revolucionaria tecnología de edición de genes que permite a los científicos realizar cambios precisos en el ADN de los organismos vivos. Originalmente descubierto como un sistema inmunológico bacteriano, se ha adaptado hasta convertirlo en una herramienta versátil para la investigación genética, la medicina y la biotecnología.
Cómo funciona CRISPR/Cas9
- Guía de diseño de ARN
Se diseña un ARN guía corto (ARNg) para que sea complementario a la secuencia de ADN objetivo. El ARNg tiene aproximadamente 20 nucleótidos de largo y determina dónde cortará la enzima Cas9. La secuencia objetivo debe ir seguida directamente de una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM), normalmente NGG.
- Formación compleja
El ARNg se combina con la proteína Cas9, formando un complejo de ribonucleoproteína. El ARNg actúa como un GPS y guía a Cas9 a la ubicación exacta del genoma que coincide con la secuencia del ARNg.
- Unión y escisión del ADN
El complejo Cas9-gRNA escanea el ADN en busca de la secuencia PAM. Una vez encontrado, Cas9 desenrolla el ADN y comprueba si la secuencia adyacente coincide con el ARNg. Si coincide, Cas9 crea una rotura de doble cadena en el ADN.
- Reparación del ADN
Los mecanismos de reparación naturales de la célula toman el control. Hay dos vías principales:
- Unión de extremos no homólogos (NHEJ): los extremos rotos se vuelven a unir directamente, provocando a menudo pequeñas inserciones o deleciones que alteran el gen.
- Reparación dirigida por homología (HDR): si se proporciona una plantilla de reparación, la célula la utiliza para realizar ediciones precisas o insertar nuevo material genético.
- Verificación Las células u organismos editados se analizan mediante PCR y se secuencian para confirmar que la modificación genética deseada fue exitosa.
Diseño práctico de experimentos CRISPR
Diseñar la guía RNA utilizando una herramienta online como CRISPick (Broad Institute) o CHOPCHOP. Ingrese la secuencia del gen objetivo y seleccione el ARNg mejor clasificado con sitios fuera del objetivo mínimos previstos (puntuación MIT baja). Ordene el gRNA como dos oligonucleótidos complementarios con salientes para la clonación en un vector de expresión (por ejemplo, pX459 para SpCas9 y selección de puromicina), o compre un gRNA transcrito in vitro y una proteína Cas9 recombinante para la entrega de RNP. Para la formación de RNP, mezcle 100 pmol de proteína Cas9 con 120 pmol de gRNA en 10 l de PBS, incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Entregue el RNP en 2 × 10 ^ 5 células mediante electroporación utilizando un sistema Neon o Lonza con el programa recomendado para el tipo de célula. Después de 48 horas, extraiga el ADN genómico y amplifique por PCR la región objetivo (300–600 pb centrada en el sitio de corte). Sanger secuencia el producto de PCR y analiza el cromatograma usando ICE (Inferencia de ediciones CRISPR) o el software TIDE; estas herramientas descomponen las trazas mixtas para cuantificar la eficiencia de la edición (porcentaje de indel) e identificar las ediciones más comunes. Un experimento típico exitoso produce una eficiencia de edición del 30 al 80% en células HEK293T. Para una edición precisa mediada por HDR, coentregue una plantilla de reparación de oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN) (100–200 nt, con brazos de homología de 50 nt en cada lado) a 10 pmol por reacción.
Aplicación del mundo real
En estudios de inactivación del gen TP53 en células HCT116, se diseña un ARNg dirigido al exón 4 mediante CRISPick. La electroporación RNP logra una eficiencia de edición del 65% mediante análisis ICE. La clonación unicelular aísla un clon knockout homocigótico confirmado mediante secuenciación de Sanger que muestra una deleción de 2 pb que provoca un cambio de marco y un codón de parada prematuro. La transferencia Western confirma la ausencia de proteína p53.
