La digestión con enzimas de restricción es una técnica utilizada para cortar el ADN en sitios específicos y predeterminados. Las enzimas de restricción, también llamadas endonucleasas de restricción, son tijeras moleculares que reconocen secuencias palindrómicas cortas de ADN y escinden el ADN en estos sitios o cerca de ellos.

Cómo funciona la digestión con enzimas de restricción

1. Elegir la enzima

Cada enzima de restricción reconoce una secuencia de ADN específica, normalmente de 4 a 8 pares de bases de longitud. Los ejemplos comunes incluyen EcoRI (GAATTC) y HindIII (AAGCTT). Los científicos eligen las enzimas en función de dónde cortan en relación con la región de interés del ADN.

2. Preparando la reacción

El ADN purificado se mezcla con la enzima de restricción, un tampón específico para esa enzima y agua. El tampón proporciona la concentración de sal y el pH óptimos para que funcione la enzima. La mezcla se incuba a la temperatura óptima de la enzima, normalmente 37°C.

3. Incubación

Durante la incubación, la enzima escanea el ADN en busca de su secuencia de reconocimiento. Al encontrar una coincidencia, corta la columna vertebral del ADN en lugares precisos. Si el ADN contiene múltiples sitios de reconocimiento, se cortará en múltiples fragmentos de distintos tamaños.

4. Inactivación por calor

Después de un tiempo de incubación suficiente, la reacción suele calentarse a 65-80 °C para desnaturalizar e inactivar la enzima, deteniendo la digestión. Los fragmentos de ADN resultantes pueden luego analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa o usarse en aplicaciones posteriores como la clonación.

Protocolo práctico de resumen de restricciones

Configure una reacción de 20 a 50 l en un tubo de microcentrífuga. Para una digestión única, combine 1 g de ADN, 2 l de tampón de restricción 10 × (seleccione el tampón recomendado por el fabricante), 10 U de enzima de restricción (normalmente 1 l) y agua libre de nucleasa hasta el volumen final. Mezcle suavemente pipeteando e incube a la temperatura óptima de la enzima (normalmente 37 °C) durante 1 hora. Para digestiones dobles, utilice un tampón compatible con ambas enzimas; la mayoría de los fabricantes proporcionan una tabla de compatibilidad. Si ningún tampón proporciona >75% de actividad para ambas enzimas, realice digestiones secuenciales: primero con la enzima que requiere menos sal, limpie el ADN y luego digiera con la segunda enzima. Incluya siempre una reacción de control sin enzima para confirmar que el ADN no se degrada. Después de la incubación, inactive con calor a 65–80 °C durante 20 minutos (si la enzima es termolábil) o purifique el ADN digerido utilizando un kit de limpieza de columnas. Analizar 5-10 l mediante electroforesis en gel de agarosa. Solucione los problemas de digestión incompleta extendiendo el tiempo de incubación a 2 a 4 horas, agregando enzima nueva después de 1 hora o usando 2 a 5 U por µg de ADN. Si el ADN es un plásmido superenrollado, es posible que se necesiten de 2 a 3 horas para una linealización completa. Para el ADN genómico, utilice de 2 a 5 U por µg e incube durante la noche.

Aplicación del mundo real

Al clonar un gen humano (2 kb) en pUC19, tanto el producto de la PCR como el vector se digieren con EcoRI y HindIII. Una doble digestión en el tampón CutSmart produce puntas pegajosas compatibles. Después de 1 hora a 37°C, la purificación en gel aísla el vector linealizado (2,7 kb) y el inserto (2 kb). La ligación y transformación en E. coli produce colonias, el 80% de las cuales contienen el inserto correcto según la PCR de colonias.