La digestión con enzimas de restricción es una técnica utilizada para cortar el ADN en sitios específicos predeterminados. Las enzimas de restricción—también llamadas endonucleasas de restricción—son tijeras moleculares que reconocen secuencias cortas y palindrómicas de ADN y cortan el ADN en o cerca de estos sitios.
Cómo funciona la digestión con enzimas de restricción
- Elección de la enzima
Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de ADN, generalmente de 4 a 8 pares de bases de longitud. Ejemplos comunes incluyen EcoRI (GAATTC) y HindIII (AAGCTT). Los científicos eligen las enzimas según dónde cortan en relación con la región de ADN de interés.
- Preparación de la reacción
El ADN purificado se mezcla con la enzima de restricción, un tampón específico para esa enzima y agua. El tampón proporciona la concentración de sal y el pH óptimos para que la enzima funcione. La mezcla se incuba a la temperatura óptima de la enzima, generalmente 37°C.
- Incubación
Durante la incubación, la enzima escanea el ADN en busca de su secuencia de reconocimiento. Al encontrar una coincidencia, corta la cadena principal de ADN en ubicaciones precisas. Si el ADN contiene múltiples sitios de reconocimiento, se cortará en múltiples fragmentos de diversos tamaños.
- Inactivación térmica
Después de un tiempo de incubación suficiente, la reacción a menudo se calienta a 65–80°C para desnaturalizar e inactivar la enzima, deteniendo la digestión. Los fragmentos de ADN resultantes pueden analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa o utilizarse en aplicaciones posteriores como la clonación.
