CRISPR/Cas9 est une technologie révolutionnaire d’édition génétique qui permet aux scientifiques d’apporter des modifications précises à l’ADN des organismes vivants. Découvert à l’origine comme système immunitaire bactérien, il a été adapté pour devenir un outil polyvalent pour la recherche génétique, la médecine et la biotechnologie.
Comment fonctionne CRISPR/Cas9
- Guider la conception de l’ARN
Un court ARN guide (ARNg) est conçu pour être complémentaire de la séquence d’ADN cible. L’ARNg mesure environ 20 nucléotides de long et détermine où l’enzyme Cas9 va couper. La séquence cible doit être directement suivie d’une séquence de motif adjacent au protoespaceur (PAM), généralement NGG.
- Formation complexe
L’ARNg est combiné à la protéine Cas9, formant un complexe ribonucléoprotéique. L’ARNg agit comme un GPS, guidant Cas9 vers l’emplacement exact du génome qui correspond à la séquence de l’ARNg.
- Liaison et clivage de l’ADN
Le complexe Cas9-gRNA analyse l’ADN à la recherche de la séquence PAM. Une fois trouvé, Cas9 déroule l’ADN et vérifie si la séquence adjacente correspond à l’ARNg. Si cela correspond, Cas9 crée une cassure double brin dans l’ADN.
- Réparation de l’ADN
Les mécanismes naturels de réparation de la cellule prennent le relais. Il existe deux voies principales :
- Jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) : les extrémités cassées sont directement rejointes, provoquant souvent de petites insertions ou délétions qui perturbent le gène.
- Réparation dirigée par homologie (HDR) : si un modèle de réparation est fourni, la cellule l’utilise pour effectuer des modifications précises ou insérer du nouveau matériel génétique.
- Vérification Les cellules ou organismes édités sont analysés par PCR et séquencés pour confirmer que la modification génétique souhaitée a réussi.
Conception d’expériences CRISPR pratiques
Concevoir l’ARN guide à l’aide d’un outil en ligne tel que CRISPick (Broad Institute) ou CHOPCHOP. Entrez la séquence du gène cible et sélectionnez l’ARNg le mieux classé avec un minimum de sites hors cible prévus (faible score MIT). Commandez l’ARNg sous forme de deux oligonucléotides complémentaires avec des surplombs pour le clonage dans un vecteur d’expression (par exemple, pX459 pour SpCas9 et sélection de puromycine), ou achetez un ARNg transcrit in vitro et une protéine Cas9 recombinante pour l’administration de RNP. Pour la formation de RNP, mélanger 100 pmol de protéine Cas9 avec 120 pmol d’ARNg dans 10 µL de PBS, incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Livrez le RNP dans 2 × 10^5 cellules par électroporation à l’aide d’un système Neon ou Lonza avec le programme recommandé pour le type de cellule. Après 48 heures, extrayez l’ADN génomique et amplifiez par PCR la région cible (300 à 600 pb centrées sur le site coupé). Sanger séquence le produit PCR et analyse le chromatogramme à l’aide du logiciel ICE (Inference of CRISPR Edits) ou TIDE – ces outils décomposent les traces mixtes pour quantifier l’efficacité de l’édition (pourcentage indel) et identifier les modifications les plus courantes. Une expérience réussie typique donne une efficacité d’édition de 30 à 80 % dans les cellules HEK293T. Pour une édition précise médiée par HDR, co-livrez un modèle de réparation d’oligodésoxynucléotide simple brin (ssODN) (100 à 200 nt, avec des bras d’homologie de 50 nt de chaque côté) à 10 pmol par réaction.
Application du monde réel
Dans les études knock-out du gène TP53 dans les cellules HCT116, un ARNg ciblant l’exon 4 est conçu via CRISPick. L’électroporation RNP atteint une efficacité d’édition de 65 % grâce à l’analyse ICE. Le clonage unicellulaire isole un clone knock-out homozygote confirmé par le séquençage de Sanger montrant une délétion de 2 pb provoquant un décalage du cadre de lecture et un codon d’arrêt prématuré. Le Western blot confirme l’absence de protéine p53.
