La ligature et le clonage de l’ADN sont un ensemble de techniques utilisées pour assembler des fragments d’ADN et les insérer dans un vecteur (une molécule d’ADN porteuse) pour la réplication à l’intérieur d’un organisme hôte, généralement une bactérie. Cela permet aux scientifiques de produire de grandes quantités d’une séquence d’ADN spécifique.

Comment fonctionnent la ligature et le clonage de l’ADN

1. Préparation de l’insert et du vecteur

Le fragment d’ADN d’intérêt (l’insert) et le vecteur (généralement un plasmide) sont coupés avec les mêmes [enzymes de restriction] (/guides/restriction-enzyme-digestion.html). Cela crée des extrémités collantes complémentaires : des surplombs courts et monocaténaires qui peuvent s’associer les uns aux autres.

2. Ligature

L’insert coupé et le vecteur sont mélangés avec de l’ADN ligase, une enzyme qui scelle le squelette sucre-phosphate de l’ADN. Les extrémités collantes complémentaires s’alignent et la ligase forme des liaisons covalentes, joignant l’insert de manière permanente au vecteur.

3. Transformations

Le plasmide ligaturé est introduit dans les cellules bactériennes compétentes par un processus appelé transformation. Ceci est souvent réalisé par choc thermique ou électroporation, qui rend la membrane bactérienne temporairement perméable à l’ADN.

4. Sélection

Les bactéries transformées sont étalées sur gélose contenant un antibiotique. Le plasmide porte un gène de résistance aux antibiotiques, de sorte que seules les bactéries qui ont absorbé le plasmide survivent. Cela crée des colonies, chacune descendant d’une seule cellule contenant l’ADN cloné.

5. Dépistage

Les colonies sont examinées par colony PCR ou par digestion par restriction pour confirmer qu’elles contiennent le bon insert. Les colonies positives sont cultivées en culture liquide pour produire de grandes quantités du plasmide souhaité.

Protocole pratique de ligature

Calculez le rapport molaire insert:vecteur optimal à l’aide de la formule : masse de l’insert (ng) = (masse du vecteur (ng) × taille de l’insert (kb) / taille du vecteur (kb)) × rapport souhaité. Pour le clonage standard, utilisez un rapport molaire insert:vecteur de 3:1. Mettre en place une réaction de ligature de 10 µL : 50 ng de vecteur linéarisé, la masse calculée d’insert, 1 µL de tampon 10× T4 ADN ligase (contenant de l’ATP), 1 µL d’ADN ligase T4 (400 U/µL) et de l’eau à 10 µL. Incluez deux contrôles : une ligature vectorielle uniquement (sans insert) pour mesurer le fond de l’auto-ligature et un contrôle sans ligase. Incuber à 16°C pendant 1 à 2 heures ou à 4°C toute la nuit pour une efficacité maximale. Pour les ligatures à extrémités franches, utilisez 1 µL de ligase et incubez à 16°C pendant 16 heures. Après ligature, transformer 2 à 5 µL en 50 µL de cellules E. coli compétentes par choc thermique : incuber sur glace pendant 30 minutes, chauffer à 42°C pendant 45 secondes, remettre dans la glace pendant 2 minutes, ajouter 950 µL de milieu SOC et incuber à 37°C pendant 1 heure sous agitation. Plaque 100 µL sur LB-agar avec l’antibiotique approprié et, si vous utilisez un dépistage bleu-blanc, ajoutez 40 µL de X-gal (20 mg/mL) et 40 µL d’IPTG (100 mM). Les colonies blanches indiquent une insertion réussie (gène lacZ perturbé), tandis que les colonies bleues contiennent un vecteur auto-ligaturé. Une bonne ligature devrait produire 10 à 100 fois plus de colonies que le contrôle vectoriel uniquement, avec > 70 % de colonies blanches.

Application du monde réel

Lors du clonage d’un gène GFP de 0,8 kb dans pUC19 (2,7 kb) avec un rapport molaire de 3:1, la ligature produit environ 200 colonies sur des plaques d’ampicilline-X-gal. Parmi eux, 165 (82 %) sont blancs. La PCR sur 10 colonies blanches confirme l’insertion de GFP dans les 10, démontrant une ligature et un criblage efficaces.