La ligation et le clonage de l’ADN sont un ensemble de techniques utilisées pour joindre des fragments d’ADN et les insérer dans un vecteur — une molécule d’ADN porteuse — pour la réplication à l’intérieur d’un organisme hôte, généralement des bactéries. Cela permet aux scientifiques de produire de grandes quantités d’une séquence d’ADN spécifique.
Comment Fonctionnent la Ligation et le Clonage de l’ADN
- Préparation de l’Insert et du Vecteur
Le fragment d’ADN d’intérêt (l’insert) et le vecteur (généralement un plasmide) sont tous deux coupés avec les mêmes enzymes de restriction. Cela crée des extrémités cohésives complémentaires — de courtes séquences simple brin en surplomb qui peuvent s’apparier entre elles.
- Ligation
L’insert et le vecteur coupés sont mélangés avec l’ADN ligase, une enzyme qui scelle le squelette sucre-phosphate de l’ADN. Les extrémités cohésives complémentaires s’alignent, et la ligase forme des liaisons covalentes, joignant l’insert de façon permanente dans le vecteur.
- Transformation
Le plasmide ligaturé est introduit dans des bactéries compétentes par un processus appelé transformation. Ceci est souvent réalisé par choc thermique ou électroporation, qui rend la membrane bactérienne temporairement perméable à l’ADN.
- Sélection
Les bactéries transformées sont étalées sur une gélose contenant un antibiotique. Le plasmide porte un gène de résistance aux antibiotiques, donc seules les bactéries ayant absorbé le plasmide survivent. Cela crée des colonies, chacune descendante d’une seule cellule contenant l’ADN cloné.
- Criblage
Les colonies sont criblées par PCR sur colonie ou digestion par restriction pour confirmer qu’elles contiennent le bon insert. Les colonies positives sont cultivées dans un milieu liquide pour produire de grandes quantités du plasmide désiré.
