La spectroscopie UV-Vis (Ultraviolet-Visible) est une technique analytique qui mesure l’absorption de la lumière dans les régions ultraviolette (190-400 nm) et visible (400-800 nm) du spectre électromagnétique. Elle est largement utilisée pour l’analyse quantitative, les études cinétiques et la caractérisation des transitions électroniques dans les molécules.

Principe de l’Absorption UV-Vis

Lorsque la lumière traverse un échantillon, les molécules absorbent les photons dont l’énergie correspond à la différence d’énergie entre les orbitales électroniques, promouvant les électrons de l’état fondamental à un état excité. La quantité de lumière absorbée à chaque longueur d’onde est enregistrée sous forme de spectre d’absorbance, et la longueur d’onde d’absorption maximale (λmax) est caractéristique de chaque chromophore. La Loi de Beer-Lambert (A = εcl) relie l’absorbance (A) à l’absorptivité molaire (ε), au trajet optique (l) et à la concentration (c), permettant la quantification.

Instrumentation

Un spectromètre UV-Vis comprend plusieurs composants. Une lampe au deutérium fournit la lumière pour la gamme UV et une lampe tungstène-halogène pour la gamme visible. Un monochromateur (réseau de diffraction ou prisme) sélectionne une bande étroite de longueurs d’onde. Le compartiment échantillon contient une cuve en quartz pour les mesures UV ou une cuve en verre pour les mesures dans le visible, et un détecteur (tube photomultiplicateur ou barrette de photodiodes) convertit la lumière transmise en signal électrique. Les instruments à double faisceau divisent la lumière en faisceaux échantillon et référence pour corriger les fluctuations du solvant et de la lampe.

Applications

La spectroscopie UV-Vis est utilisée pour l’analyse quantitative des acides nucléiques (A260), des protéines (A280) et de la cinétique enzymatique, la détermination des valeurs de pKa en mesurant les changements d’absorbance avec le pH, le contrôle qualité des produits pharmaceutiques, des colorants alimentaires et des polluants de l’eau, et la caractérisation des complexes de métaux de transition et des composés organiques conjugués.

Avantages et Limites

• Avantages : Rapide, non destructif, nécessite de petits volumes d’échantillon et est relativement peu coûteux.
• Limites : Ne mesure que les espèces chromophoriques ; les échantillons doivent être transparents et exempts de particules diffusantes.