Histokimia enzim adalah studi tentang aktivitas enzim dalam irisan jaringan. Tidak seperti imunohistokimia, yang mendeteksi keberadaan protein enzim (aktif atau tidak aktif), histokimia enzim mendeteksi aktivitas fungsional — kemampuan enzim untuk mengkatalisis reaksi spesifiknya. Informasi fungsional ini sering lebih relevan untuk keadaan penyakit daripada sekadar keberadaan protein.
Prinsip
Histokimia enzim bergantung pada reaksi penangkapan di mana produk dari reaksi yang dikatalisis enzim diendapkan di tempat aktivitas. Irisan jaringan diinkubasi dalam larutan substrat yang mengandung substrat spesifik enzim dan reagen penangkap. Enzim mengubah substrat; produk reaksi ditangkap oleh reagen untuk membentuk endapan berwarna tak larut yang terlihat di bawah mikroskop cahaya.
Reaksi harus: spesifik (enzim harus satu-satunya yang dapat menggunakan substrat dalam kondisi yang digunakan); produk harus tak larut (untuk tetap di tempat aktivitas); dan endapan harus terlihat (berwarna, fluoresen, atau padat elektron untuk lokalisasi ultrastruktural).
Fiksasi dan Preservasi Aktivitas Enzim
Fiksasi adalah variabel paling kritis dalam histokimia enzim. Formalin dan fiksatif pengikat-silang lainnya menghambat sebagian besar enzim — tingkat inhibisi tergantung pada waktu fiksasi, suhu, dan enzim spesifik. Fiksasi singkat (2-4 jam dalam formalin dingin atau formol-kalsium) mempertahankan beberapa aktivitas enzim sambil mempertahankan morfologi yang memadai. Irisan beku tanpa fiksasi (irisan kriostat dari jaringan beku cepat) memberikan aktivitas enzim tertinggi tetapi morfologi lebih buruk.
Fiksasi dingin (4°C) mengurangi inaktivasi enzim. Fiksasi aseton (4°C, 30-60 menit) mempertahankan banyak enzim lebih baik daripada formalin. Tanpa fiksasi — irisan beku segar dapat digunakan untuk enzim yang sepenuhnya diinaktivasi oleh fiksatif apa pun. Pasca-fiksasi (inkubasi irisan untuk reaksi enzim terlebih dahulu, lalu fiksasi) adalah pendekatan alternatif.
Metode Deteksi
Penangkapan simultan — reaksi enzim dan pengendapan penangkapan terjadi pada waktu yang sama. Substrat dan reagen penangkap dicampur dalam medium inkubasi. Sebagian besar hidrolase (asam fosfatase, alkalin fosfatase, esterase) didemonstrasikan dengan penangkapan simultan menggunakan garam diazonium sebagai reagen penangkap.
Kopling pasca-inkubasi — reaksi enzim menciptakan produk reaksi primer yang kemudian digandengkan dengan reagen penangkap dalam langkah kedua. Metode ini digunakan untuk enzim di mana produk primer tidak stabil atau di mana reagen penangkap mengganggu aktivitas enzim.
Metode garam logam — produk reaksi enzim (misalnya, fosfat dari aktivitas fosfatase) ditangkap oleh ion logam (timbal, kobalt, tembaga) untuk membentuk garam logam tak larut yang padat elektron. Metode ini kompatibel dengan mikroskop cahaya dan elektron.
Metode garam tetrazolium — digunakan untuk dehidrogenase dan oksidoreduktase. Enzim mentransfer elektron ke NAD(P) atau FAD, yang kemudian mereduksi garam tetrazolium menjadi endapan formazan berwarna tak larut. Garam tetrazolium yang berbeda (NBT, MTT, INT) menghasilkan formazan dengan warna berbeda (biru, ungu, merah).
Kontrol
Kontrol sangat penting untuk memvalidasi reaksi histokimia enzim. Kontrol positif — jaringan yang diketahui mengandung enzim (hati untuk sebagian besar enzim metabolik, ginjal untuk fosfatase, otot rangka untuk dehidrogenase). Kontrol negatif — jaringan yang sama diinkubasi tanpa substrat, dengan inhibitor enzim spesifik, atau dengan enzim yang diinaktivasi panas (irisan direbus). Kontrol inhibisi menggunakan inhibitor enzim spesifik (misalnya, natrium fluorida untuk asam fosfatase) mengkonfirmasi bahwa reaksi disebabkan oleh enzim target dan bukan enzim yang bereaksi silang.
Aplikasi
Histokimia enzim digunakan dalam patologi otot (pengetikan serat otot oleh reaksi ATPase dan NADH-TR — penting untuk mendiagnosis miopati), patologi hati (defisiensi enzim pada penyakit hati metabolik), patologi ginjal (pola enzim pada cedera tubulus), dan patologi tumor (alkalin fosfatase pada osteosarkoma, esterase non-spesifik pada tumor histiositik). Meskipun IHC telah menggantikan banyak aplikasi histokimia enzim, histokimia enzim tetap tak tergantikan untuk menunjukkan aktivitas enzim fungsional, terutama dalam diagnosis penyakit otot dan metabolik. Jaminan mutu mencakup validasi rutin aktivitas enzim menggunakan kontrol positif dan negatif.
