A PCR de colônia é uma técnica de triagem rápida usada para determinar se as colônias bacterianas contêm um plasmídeo com o inserto de DNA correto. Em vez de purificar o DNA plasmidial de cada colônia primeiro, a PCR é realizada diretamente em uma pequena quantidade de células bacterianas.
Como Funciona a PCR de Colônia
- Seleção de Colônias
Colônias bacterianas individuais crescendo em uma placa de ágar são coletadas usando uma ponta de pipeta estéril ou palito. Cada colônia é tocada brevemente, transferindo uma pequena quantidade de células. A mesma ponta é usada para inocular tanto o tubo de PCR quanto uma placa mestre para cultura posterior.
- Lise Celular
As células bacterianas são aquecidas a 95°C por vários minutos durante a etapa inicial de desnaturação da PCR. Este tratamento térmico lisa as células, liberando o DNA plasmidial na mistura da reação. O DNA liberado então serve como molde para amplificação.
- Amplificação por PCR
Primers que flanqueiam a região do inserto no plasmídeo são usados. Se a colônia contiver um plasmídeo com o inserto correto, a PCR produzirá uma banda no tamanho esperado. Se o plasmídeo estiver vazio (sem inserto), a banda será menor. Se a colônia não contiver o plasmídeo, nenhuma banda será produzida.
- Análise em Gel
Os produtos da PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose. Colônias que produzem uma banda no tamanho esperado do inserto são identificadas como positivas. Estas colônias podem então ser cultivadas para purificação do plasmídeo e análises posteriores.
- Vantagens
A PCR de colônia é rápida e barata, permitindo que dezenas de colônias sejam triadas em poucas horas. Elimina a necessidade de purificação de plasmídeo antes da triagem e é uma etapa inicial padrão em fluxos de trabalho de clonagem molecular.
