Osso, dentes e tecidos calcificados não podem ser seccionados em um micrótomo sem a remoção prévia dos sais de cálcio. A descalcificação (descalc) amolece o tecido extraindo íons de cálcio, deixando a matriz orgânica intacta para processamento e corte. A escolha do método de descalcificação depende da urgência dos resultados e de quais testes a jusante estão planejados.
Por que Descalcificar?
Os cristais de hidroxiapatita de cálcio (Ca10(PO4)6(OH)2) no osso e calcificações patológicas tornam o tecido duro demais para o corte no micrótomo. Mesmo espécimes ósseos finos (ex., biópsias de trefina de medula óssea descalcificadas) quebrarão a lâmina do micrótomo ou produzirão seções inutilizáveis se não forem descalcificados. A descalcificação é necessária para todo tecido mineralizado, incluindo osso, dentes, válvulas cardíacas calcificadas, artérias ateroscleróticas e calcificações tumorais.
Descalcificação Ácida
Ácidos fortes (ácido nítrico, 5-10%, ácido fórmico, 10-20%) descalcificam rapidamente — fragmentos ósseos pequenos em 2-6 horas, osso cortical em 24-48 horas. O ácido nítrico é o mais rápido, mas pode hidrolisar ácidos nucleicos e degradar proteínas, comprometendo IHQ e testes moleculares. O ácido fórmico é mais suave e preferido quando IHQ ou PCR estão planejados.
Mecanismo de descalcificação ácida — prótons (H+) deslocam íons de cálcio da hidroxiapatita, formando sais de cálcio solúveis que se difundem para fora do tecido. A taxa de reação depende da concentração do ácido, temperatura (aumentar a temperatura acelera, mas aumenta o dano tecidual) e agitação. O ponto final é determinado por teste químico do fluido de descalcificação para cálcio (oxalato ou tira de teste de cálcio) ou por avaliação física (o tecido dobra sem resistência).
Agentes quelantes (EDTA, ácido etilenodiaminotetracético, 10-14%, pH 7,0-7,4) descalcificam ligando íons de cálcio em um complexo quelato estável. O EDTA é muito mais lento que os ácidos — a descalcificação leva de 2 a 14 dias, dependendo do tamanho e densidade do tecido — mas preserva morfologia, antigenicidade e ácidos nucleicos melhor que qualquer método ácido. O EDTA é o método de descalcificação preferido quando IHQ, FISH ou PCR serão realizados. A descalcificação com EDTA a 4°C é ainda mais lenta (3-4 semanas), mas fornece preservação otimizada de ácidos nucleicos.
Protocolos de Descalcificação
Biópsias de trefina de medula óssea — fixadas em formalina por 2-4 horas, descalcificadas em EDTA ou ácido fórmico por 2-4 horas (núcleos pequenos) a 24 horas (núcleos grandes). A superdescalcificação destrói o detalhe celular da medula e compromete a IHQ para marcadores linfoides e de plasmócitos.
Cabeças femorais e espécimes ósseos grandes — fixados em formalina por 24-48 horas, seccionados em uma serra de fita em fatias de 3-5 mm de espessura, descalcificados em solução de ácido fórmico-citrato de sódio ou EDTA por 2-7 dias. Troque a solução de descalcificação diariamente. Teste o ponto final com oxalato de amônio — a formação de um precipitado indica que o cálcio ainda está sendo liberado.
Tumores de partes moles calcificados — descalcifique em EDTA para preservar a antigenicidade da IHQ. A descalcificação ácida pode mascarar marcadores essenciais para a classificação tumoral.
Detecção do Ponto Final
Teste químico — adicione 1 mL do fluido de descalcificação a 5 mL de solução de oxalato de amônio; um precipitado branco (oxalato de cálcio) dentro de 30 segundos indica que a descalcificação está incompleta. Raio-X — os espécimes podem ser radiografados para detectar calcificação residual. Físico — um alfinete de segurança dobrado ou lâmina de bisturi deve passar através do tecido sem resistência; o tecido deve parecer queijo firme, não osso.
Artefatos e Problemas
Superdescalcificação — o problema mais comum. Exposição ácida excessiva destrói a basofilia nuclear (H&E mostra núcleos pálidos, fantasmas), fragmenta DNA (falha de PCR) e desnatura proteínas (IHQ falsos negativos). A superdescalcificação com EDTA é menos danosa, mas ainda deve ser evitada. Subdescalcificação — as seções contêm áreas duras e arenosas que rasgam a seção ou danificam a lâmina; retrate o bloco em solução de descalcificação por tempo adicional. Pigmento de hematina ácida — cristais birrefringentes marrom-escuros da interação ácida com hemoglobina fixada em formalina; removido por tratamento com ácido pícrico alcoólico saturado.
Controle de Qualidade
Documente método de descalcificação, tempo, temperatura e ponto final. Avalie a preservação nuclear na H&E — tecido bem descalcificado mostra detalhe nuclear nítido comparável ao tecido não descalcificado. Controles de IHQ devem incluir tecido descalcificado para verificar a preservação do antígeno. Controles positivos para IHQ devem ser descalcificados pelo mesmo método que o tecido teste. A participação em programas de EQA para patologia óssea e de medula óssea inclui avaliação da qualidade da descalcificação.
