O sequenciamento Sanger, também conhecido como sequenciamento por terminação de cadeia, é um método usado para determinar a ordem exata dos nucleotídeos em uma molécula de DNA. Desenvolvido por Frederick Sanger em 1977, continua sendo o padrão ouro para validar sequências de DNA e detectar mutações.
Como Funciona o Sequenciamento Sanger
- Preparação da Reação
O DNA a ser sequenciado é misturado com um primer de DNA, DNA polimerase, nucleotídeos normais (dNTPs) e uma pequena quantidade de dideoxinucleotídeos fluorescentemente marcados (ddNTPs). Cada um dos quatro ddNTPs é marcado com um corante fluorescente diferente.
- Terminação da Cadeia
A reação começa com o primer se ligando ao DNA molde. A DNA polimerase estende o primer adicionando dNTPs. Sempre que um ddNTP é incorporado em vez de um dNTP, a cadeia para de crescer porque os ddNTPs não possuem o grupo 3’-hidroxila necessário para extensão adicional.
- Geração de Fragmentos
Este processo produz uma mistura de fragmentos de DNA de comprimentos variados, cada um terminando em uma posição específica de nucleotídeo. O marcador fluorescente no ddNTP terminal identifica qual base está no final de cada fragmento.
- Eletroforese Capilar
A mistura é carregada em um instrumento de eletroforese capilar. Os fragmentos são separados por tamanho à medida que migram através do capilar. Um laser excita os marcadores fluorescentes, e um detector registra qual cor passa em cada ponto no tempo.
- Análise do Cromatograma
O instrumento produz um cromatograma — uma série de picos coloridos representando a sequência de nucleotídeos. A sequência é lida a partir do cromatograma, tipicamente do fragmento mais curto ao mais longo, fornecendo a sequência completa de DNA.
