La secuenciación Sanger, también conocida como secuenciación por terminación de cadena, es un método utilizado para determinar el orden exacto de los nucleótidos en una molécula de ADN. Desarrollada por Frederick Sanger en 1977, sigue siendo el estándar de oro para validar secuencias de ADN y detectar mutaciones.
Cómo funciona la secuenciación Sanger
- Preparación de la reacción
El ADN a secuenciar se mezcla con un cebador de ADN, ADN polimerasa, nucleótidos normales (dNTP) y una pequeña cantidad de didesoxinucleótidos marcados fluorescentemente (ddNTP). Cada uno de los cuatro ddNTP está marcado con un colorante fluorescente diferente.
- Terminación de cadena
La reacción comienza con el cebador uniéndose al ADN molde. La ADN polimerasa extiende el cebador añadiendo dNTP. Cada vez que se incorpora un ddNTP en lugar de un dNTP, la cadena deja de crecer porque los ddNTP carecen del grupo 3’-hidroxilo necesario para la extensión.
- Generación de fragmentos
Este proceso produce una mezcla de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno terminando en una posición de nucleótido específica. La marca fluorescente en el ddNTP de terminación identifica qué base está al final de cada fragmento.
- Electroforesis capilar
La mezcla se carga en un instrumento de electroforesis capilar. Los fragmentos se separan por tamaño a medida que migran a través del capilar. Un láser excita las marcas fluorescentes y un detector registra qué color pasa en cada punto temporal.
- Análisis del cromatograma
El instrumento produce un cromatograma—una serie de picos de colores que representan la secuencia de nucleótidos. La secuencia se lee del cromatograma, típicamente desde el fragmento más corto al más largo, dando la secuencia completa de ADN.
