Le séquençage Sanger, également connu sous le nom de séquençage par terminaison de chaîne, est une méthode utilisée pour déterminer l’ordre exact des nucléotides dans une molécule d’ADN. Développé par Frederick Sanger en 1977, il reste la référence pour valider les séquences d’ADN et détecter les mutations.
Comment Fonctionne le Séquençage Sanger
- Configuration de la Réaction
L’ADN à séquencer est mélangé avec une amorce d’ADN, une ADN polymérase, des nucléotides normaux (dNTP) et une petite quantité de didésoxynucléotides (ddNTP) marqués par fluorescence. Chacun des quatre ddNTP est marqué avec un colorant fluorescent différent.
- Terminaison de Chaîne
La réaction commence par la liaison de l’amorce à l’ADN matrice. L’ADN polymérase allonge l’amorce en ajoutant des dNTP. Chaque fois qu’un ddNTP est incorporé au lieu d’un dNTP, la chaîne cesse de croître car les ddNTP manquent du groupe 3’-hydroxyle nécessaire à l’extension ultérieure.
- Génération de Fragments
Ce processus produit un mélange de fragments d’ADN de longueurs variées, chacun se terminant à une position nucléotidique spécifique. Le marqueur fluorescent sur le ddNTP terminateur identifie quelle base se trouve à l’extrémité de chaque fragment.
- Électrophorèse Capillaire
Le mélange est chargé dans un instrument d’électrophorèse capillaire. Les fragments sont séparés par taille en migrant à travers le capillaire. Un laser excite les marqueurs fluorescents, et un détecteur enregistre quelle couleur passe à chaque instant.
- Analyse du Chromatogramme
L’instrument produit un chromatogramme — une série de pics colorés représentant la séquence des nucléotides. La séquence est lue à partir du chromatogramme, généralement du fragment le plus court au plus long, donnant la séquence complète de l’ADN.
