A fixação é o primeiro e mais crítico passo na preservação de tecidos. Ela interrompe a decomposição celular, estabiliza macromoléculas e endurece o tecido para processamento e corte subsequentes. A qualidade de toda técnica subsequente — coloração H&E, IHQ, análise molecular — depende de fixação adequada e apropriada.
Objetivos da Fixação
Os objetivos primários da fixação são prevenir autólise (autodigestão por enzimas intracelulares) e putrefação (decomposição bacteriana); preservar a morfologia tecidual o mais próximo possível do estado vivo; endurecer o tecido para corte sem distorção; estabilizar componentes celulares (proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos) para coloração; e tornar as células permeáveis a corantes e anticorpos. Nenhum fixador único atinge todos os objetivos de forma otimizada — a escolha depende da aplicação subsequente pretendida.
Química da Formalina
Formalina tamponada neutra a 10% (NBF) é o fixador universal em histopatologia. A formalina comercial é uma solução aquosa a 37% de gás formaldeído — NBF a 10% é uma diluição 1:10 (formaldeído a 3,7%). O tampão neutro (fosfato de sódio monobásico e dibásico, pH 7,0-7,2) previne a formação de ácido fórmico (que causa pigmento de hematina ácida) e mantém condições ótimas de reticulação.
O formaldeído reticula proteínas formando pontes de metileno (-CH2-) entre grupos amino adjacentes, particularmente o grupo épsilon-amino da lisina e os grupos amida dos peptídeos. Isso cria uma rede de gel tridimensional que estabiliza a estrutura tecidual. A reticulação é dependente da temperatura — prossegue aproximadamente duas vezes mais rápido a 37°C que à temperatura ambiente. A fixação de rotina à temperatura ambiente requer 6-24 horas para pequenas biópsias e 24-48 horas para espécimes maiores. A regra padrão é 1 hora por mm de espessura tecidual.
Fatores que Afetam a Fixação
Volume do fixador deve ser pelo menos 10-20 vezes o volume do tecido. Volume inadequado exaure o fixador antes que a penetração seja completa. Espessura do tecido — as seções não devem ser mais espessas que 4-5 mm para penetração adequada; seções mais espessas fixam mal no centro. Temperatura — temperatura mais alta acelera a fixação, mas aumenta a autólise antes que o fixador penetre; a temperatura ambiente é ótima para uso de rotina. Agitação — rotação suave melhora a circulação do fixador ao redor do espécime. Retardo na fixação — tempo de isquemia quente (tempo desde o clampeamento vascular até a remoção do espécime) e tempo de isquemia fria (tempo desde a remoção até a fixação) devem ser minimizados. A isquemia fria prolongada degrada RNA, proteínas e fosfoproteínas (afetando IHQ, particularmente ER e marcadores fosfoespecíficos).
Tipos de Fixadores
Fixadores de reticulação (aldeídos) — formaldeído, glutaraldeído (para ME), glioxal (uma alternativa menos tóxica). O glutaraldeído fornece preservação ultraestrutural superior, mas penetra lentamente e causa mais reticulação, que pode mascarar antígenos para IHQ.
Fixadores coagulativos — etanol, metanol, acetona. Estes precipitam proteínas rompendo as camadas de hidratação em vez de reticular. Preservam atividade enzimática e ácidos nucleicos, mas causam mais encolhimento e endurecem o tecido rapidamente. A fixação por álcool é usada para PCR e testes moleculares.
Fixadores combinados — solução de Bouin (ácido pícrico, formaldeído, ácido acético) fornece excelente detalhe nuclear e é usada para tecidos endócrinos, biópsias testiculares e biópsias gastrointestinais. O fixador B5 (cloreto mercúrico, formaldeído) foi historicamente usado para linfonodos, mas agora é raramente usado devido à toxicidade do mercúrio. A formalina zincada é uma alternativa livre de mercúrio para preservação de antígenos linfoides.
Alternativas não reticulantes — fixadores moleculares (PAXgene, HOPE) preservam ácidos nucleicos e proteínas para análise molecular, mas fornecem morfologia menos otimizada que a formalina. São usados principalmente em biobancos e ambientes de pesquisa.
Processamento Pós-Fixação
Após a fixação, os espécimes são transferidos para etanol a 70% para armazenamento se o processamento for atrasado. Os tecidos podem permanecer em etanol a 70% por semanas sem efeitos adversos. O armazenamento prolongado em formalina (>72 horas) causa superfixação que aumenta o mascaramento de antígenos e a fragmentação do DNA. Para preservação de longo prazo, o tecido fixado em formalina pode ser transferido para etanol após 24-48 horas.
Controle de Qualidade
A fixação é monitorada através de frescura do fixador (soluções trocadas regularmente), tempo de fixação (documentado na requisição), aparência (tecido bem fixado é firme e uniformemente pálido) e qualidade da coloração a jusante (fixação deficiente manifesta-se como detalhe nuclear pobre, palidez ou efeitos de borda na H&E). Programas de garantia de qualidade incluem revisão regular dos indicadores de adequação da fixação.
