Visão Geral
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) tornou-se o método padrão para medir a expressão gênica, substituindo abordagens anteriores baseadas em hibridização. Ao converter moléculas de RNA em uma biblioteca de cDNA e sequenciar milhões de fragmentos, o RNA-seq fornece tanto a identidade quanto a abundância de transcritos em uma amostra biológica. Diferentemente dos microarranjos, o RNA-seq pode detectar novos transcritos, variantes de splicing e RNAs não codificantes sem necessidade de design prévio de sondas. A técnica oferece uma faixa dinâmica que abrange várias ordens de grandeza e resolução de base única. Os dados de RNA-seq sustentam a maioria dos estudos modernos de transcriptômica, desde organismos modelo até espécimes clínicos.
Conceitos-Chave
O pipeline de análise de RNA-seq começa com leituras de sequenciamento brutas, que passam por controle de qualidade (FastQC), remoção de adaptadores (Trimmomatic ou Cutadapt) e alinhamento a um genoma de referência usando alinhadores sensíveis a splicing como STAR ou HISAT2. A quantificação em nível de gene ou transcrito é realizada por ferramentas como featureCounts, RSEM ou Salmon. Os valores de expressão são normalizados como FPKM, RPKM ou TPM para levar em conta a profundidade do sequenciamento e o comprimento do transcrito. A detecção de splicing alternativo e novos transcritos requer ferramentas especializadas como Cufflinks ou StringTie, que montam transcritos a partir de leituras alinhadas. As métricas de qualidade incluem taxas de mapeamento, distribuição de leituras entre características gênicas e análise de saturação.
Aplicações
O RNA-seq é aplicado em praticamente todas as áreas da biologia. Ele profile mudanças na expressão gênica em doenças versus tecidos saudáveis, identifica biomarcadores para subtipos de câncer e rastreia programas de expressão gênica do desenvolvimento. Em microbiologia, o RNA-seq revela respostas transcricionais a antibióticos e estresse ambiental. A técnica baseia-se diretamente em métodos de sequenciamento de RNA e é frequentemente integrada a fluxos de trabalho de sequenciamento de próxima geração. O RNA-seq também permite a descoberta de novas estruturas e tipos de RNA, incluindo RNAs longos não codificantes e RNAs circulares, expandindo nossa compreensão da complexidade do transcriptoma.
