Visão Geral

A proteômica top-down analisa proteínas intactas por espectrometria de massas sem digestão enzimática prévia. Diferentemente da abordagem convencional bottom-up que infere identidades proteicas a partir de peptídeos, a proteômica top-down mede a massa intacta de uma proteína e subsequentemente a fragmenta dentro do espectrômetro de massas para obter informação de sequência. Esta abordagem preserva o contexto completo da proteína, o que significa que combinações de modificações pós-traducionais, variantes de sequência e formas de splicing alternativo — coletivamente chamadas de proteoformas — são observadas como espécies moleculares distintas. A proteômica top-down fornece portanto uma visão direta e inequívoca do panorama de proteoformas que é amplamente invisível para métodos bottom-up.

Métodos

Íons de proteínas intactas são introduzidos no espectrômetro de massas via ionização por eletrospray, que gera um envelope de estados de carga a partir do qual a massa molecular é calculada. A fragmentação é alcançada usando técnicas como dissociação por captura de elétrons (ECD) ou dissociação por transferência de elétrons (ETD), que clivam preferencialmente a cadeia principal da proteína enquanto preservam modificações lábeis como fosforilação e glicosilação. A identificação de proteoformas depende de algoritmos que comparam a massa intacta medida e os íons fragmento com um banco de dados de proteoformas previstas. Espectrômetros de massas de ultra-alta resolução, como ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier (FT-ICR) e instrumentos Orbitrap, são essenciais para resolver as pequenas diferenças de massa entre proteoformas relacionadas.

Aplicações

A proteômica top-down é excelente para caracterizar modificações pós-traducionais e seus padrões combinatórios em proteínas individuais. É usada para estudar códigos de modificação de histonas, heterogeneidade de anticorpos e produtos de degradação proteica. A abordagem complementa a proteômica e espectrometria de massas bottom-up e beneficia-se da mesma instrumentação de espectrometria de massas, enquanto fornece insights únicos sobre a biologia das proteoformas que são críticos para entender mecanismos de doenças e desenvolver terapias de precisão.