Überblick
Die Top-Down-Proteomik analysiert intakte Proteine mittels Massenspektrometrie ohne vorherigen enzymatischen Verdau. Im Gegensatz zum konventionellen Bottom-Up-Ansatz, der Proteinidentitäten aus Peptiden ableitet, misst die Top-Down-Proteomik die intakte Masse eines Proteins und fragmentiert es anschließend im Massenspektrometer, um Sequenzinformationen zu erhalten. Dieser Ansatz bewahrt den vollständigen Proteinkontext, sodass Kombinationen posttranslationaler Modifikationen, Sequenzvarianten und alternativer Spleißformen — gemeinsam als Proteoformen bezeichnet — als eigenständige molekulare Spezies beobachtet werden. Die Top-Down-Proteomik bietet daher eine direkte und eindeutige Sicht auf die Proteoformenlandschaft, die für Bottom-Up-Methoden weitgehend unsichtbar ist.
Methoden
Intakte Proteinionen werden mittels Elektrospray-Ionisation in das Massenspektrometer eingebracht, wodurch eine Ladungszustandshülle entsteht, aus der die Molekülmasse berechnet wird. Die Fragmentierung erfolgt mit Techniken wie der Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) oder der Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), die bevorzugt das Proteinrückgrat spalten, während labile Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung erhalten bleiben. Die Proteoformidentifizierung beruht auf Algorithmen, die die gemessene intakte Masse und Fragmentionen mit einer Datenbank vorhergesagter Proteoformen abgleichen. Ultrahochauflösende Massenspektrometer wie Fourier-Transform-Ionencyclotronresonanz (FT-ICR) und Orbitrap-Geräte sind für die Auflösung der kleinen Massenunterschiede zwischen verwandten Proteoformen unerlässlich.
Anwendungen
Die Top-Down-Proteomik zeichnet sich durch die Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen und ihrer kombinatorischen Muster auf einzelnen Proteinen aus. Sie wird zur Untersuchung von Histon-Modifikationscodes, Antikörperheterogenität und Proteinabba u produkten eingesetzt. Der Ansatz ergänzt die Bottom-Up-Proteomik und Massenspektrometrie und profitiert von derselben Massenspektrometrie-Instrumentierung, während er einzigartige Einblicke in die Proteoformenbiologie bietet, die für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung präziser Therapien entscheidend sind.
