Proteomik ist die groß angelegte Untersuchung von Proteinen, ihren Strukturen, Funktionen, Interaktionen und Modifikationen. Anders als das Genom, das relativ statisch ist, ist das Proteom dynamisch und spiegelt den Zustand der Zelle wider, wobei Proteinexpression, Lokalisierung, Modifikation und Umsatz alle reguliert werden.

Massenspektrometrie-Prinzipien

Die Massenspektrometrie misst das Masse-zu-Ladung-Verhältnis ionisierter Moleküle. Ein Massenspektrometer hat drei wesentliche Komponenten. Die Ionenquelle wandelt Moleküle in Gasphasenionen um. Der Massenanalysator trennt Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis. Der Detektor misst die Häufigkeit jedes Ions. Proteine und Peptide werden typischerweise unter Verwendung der Elektrospray-Ionisation oder der matrixunterstützten Laserdesorption/Ionisation analysiert.

Die Elektrospray-Ionisation erzeugt mehrfach geladene Ionen aus Peptiden in Lösung und erzeugt eine Reihe von Peaks, aus denen die Molekülmasse berechnet werden kann. MALDI erzeugt typischerweise einfach geladene Ionen aus Peptiden, die in eine kristalline Matrix eingebettet und durch einen Laserpuls desorbiert werden. Beide Methoden sind sanfte Ionisationstechniken, die die Integrität des Analyten bewahren.

Massenanalysatoren

In der Proteomik werden verschiedene Massenanalysatortypen verwendet. Quadrupol-Massenfilter übertragen Ionen eines ausgewählten Masse-zu-Ladung-Verhältnisses durch vier parallele Stäbe mit oszillierenden elektrischen Feldern. Flugzeitanalysatoren messen die Zeit, die Ionen benötigen, um eine festgelegte Strecke zurückzulegen, wobei leichtere Ionen schneller ankommen. Orbitrap-Analysatoren fangen Ionen in einem elektrostatischen Feld ein und messen ihre Oszillationsfrequenzen, was hohe Auflösung und Massengenauigkeit bietet. Ionenfallenanalysatoren halten Ionen in einem dreidimensionalen elektrischen Feld fest und stoßen sie nacheinander aus. Hybridinstrumente, die mehrere Analysatortypen kombinieren, wie Quadrupol-Orbitrap oder Triple-Quadrupol-Instrumente, bieten Flexibilität für verschiedene experimentelle Strategien.

Bottom-Up-Proteomik

Die Bottom-Up-Proteomik analysiert Proteine (oft durch SDS-PAGE aufgetrennt) nach Verdau in Peptide, typischerweise unter Verwendung von Trypsin, das nach Arginin- und Lysinresten spaltet. Die resultierende Peptidmischung wird durch Flüssigchromatographie aufgetrennt und durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Bei der datenabhängigen Akquisition wählt das Massenspektrometer die häufigsten Peptidionen zur Fragmentierung durch kollisionsinduzierte Dissoziation aus. Die resultierenden Fragmentionenspektren werden gegen Proteinsequenzdatenbanken durchsucht, um die Peptide und ihre Ursprungsproteine zu identifizieren.

Tandem-Massenspektrometrie

In der Tandem-Massenspektrometrie wird ein Vorläuferion eines spezifischen Masse-zu-Ladung-Verhältnisses ausgewählt und fragmentiert, und die Fragmentionenmassen werden gemessen. Die kollisionsinduzierte Dissoziation fragmentiert Peptide hauptsächlich an Amidbindungen und produziert b- und y-Ionen. Der Massenunterschied zwischen benachbarten y-Ionen oder b-Ionen gibt die Aminosäuresequenz preis. Hochenergetische Fragmentierungsmethoden wie der Elektronentransfer-Dissoziation liefern komplementäre Informationen und erhalten labile posttranslationale Modifikationen.

Proteinidentifizierung

Die Proteinidentifizierung aus Tandem-Massenspektren verwendet Datenbanksuchmaschinen wie Mascot, Sequest oder MaxQuant. Die beobachteten Fragmentionenmassen werden mit theoretischen Spektren verglichen, die durch In-silico-Verdau von Proteinsequenzen in einer Datenbank erzeugt werden. Die statistische Analyse bestimmt die Konfidenz jeder Identifizierung. Die De-novo-Sequenzierung, die die Peptidsequenz direkt aus dem Massenspektrum ohne Datenbank ableitet, wird für Organismen mit nicht sequenzierten Genomen oder zur Identifizierung neuer Peptide verwendet.

Quantitative Proteomik

Die quantitative Proteomik misst Veränderungen der Proteinmenge zwischen Bedingungen. Markierungsbasierte Methoden führen stabile Isotopenmarkierungen ein, die sich durch Massenverschiebungen unterscheiden. SILAC integriert isotopenmarkierte Aminosäuren durch metabolische Markierung in Zellkultur. TMT und iTRAQ verwenden chemische Markierungen, die während der Fragmentierung Reporterionen freisetzen und eine multiplexierte Quantifizierung von bis zu 16 Proben ermöglichen. Die markierungsfreie Quantifizierung vergleicht Peptidionenintensitäten oder spektrale Zählwerte über Läufe hinweg und erfordert sorgfältige Normalisierung.

Analyse posttranslationaler Modifikationen

Die Massenspektrometrie ist einzigartig geeignet für die Identifizierung und Lokalisierung posttranslationaler Modifikationen. Die Phosphorylierung wird durch eine charakteristische Massenzunahme von 80 Da und einen Neutralverlust von Phosphorsäure während der Fragmentierung nachgewiesen. Anreicherungsmethoden wie immobilisierte Metallaffinitätschromatographie oder Titandioxid-Chromatographie werden verwendet, um Phosphopeptide vor der Analyse zu reinigen. Die Glykosylierung ist anspruchsvoller, da Glykopeptide schlecht fragmentieren und Glykanstrukturen heterogen sind. Spezialisierte Fragmentierungsmethoden wie die Elektronentransfer-Dissoziation erhalten Glykan-Peptid-Bindungen und ermöglichen eine ortspezifische Analyse.

Klinische Proteomik

Die klinische Proteomik wendet proteomische Technologien auf medizinische Probleme an. Die Biomarkerentdeckung identifiziert Proteine, deren Menge sich bei Krankheiten ändert, und ermöglicht möglicherweise eine frühzeitige Diagnose oder Behandlungsüberwachung unter Verwendung von Techniken wie ELISA. Die Gewebeproteomik analysiert formalinfixierte, paraffineingebettete klinische Proben. Die Plasmaproteomik steht aufgrund des enormen dynamischen Bereichs der Proteinkonzentrationen vor Herausforderungen, wobei Albumin allein mehr als die Hälfte des Gesamtproteins ausmacht. Die Affinitätsdepletion abundanter Proteine und umfangreiche Fraktionierung sind typischerweise für eine tiefe Plasmaproteomanalyse erforderlich.