La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, sus estructuras, funciones, interacciones y modificaciones. A diferencia del genoma, que es relativamente estático, el proteoma es dinámico y refleja el estado de la célula, estando la expresión, localización, modificación y recambio de proteínas sujetas a regulación.

Principios de la Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas mide la relación masa-carga de moléculas ionizadas. Un espectrómetro de masas tiene tres componentes esenciales. La fuente de iones convierte las moléculas en iones en fase gaseosa. El analizador de masas separa los iones por su relación masa-carga. El detector mide la abundancia de cada ion. Las proteínas y péptidos se analizan típicamente mediante ionización por electrospray o ionización por desorción láser asistida por matriz.

La ionización por electrospray produce iones con múltiples cargas a partir de péptidos en solución, generando una serie de picos a partir de los cuales se puede calcular la masa molecular. MALDI produce típicamente iones con carga única a partir de péptidos incorporados en una matriz cristalina y desorbidos por un pulso láser. Ambos métodos son técnicas de ionización suave que preservan la integridad del analito.

Analizadores de Masas

Varios tipos de analizadores de masas se utilizan en proteómica. Los filtros de masas de cuadrupolo transmiten iones de una relación masa-carga seleccionada a través de cuatro barras paralelas con campos eléctricos oscilantes. Los analizadores de tiempo de vuelo miden el tiempo que los iones tardan en recorrer una distancia fija, llegando los iones más ligeros más rápido. Los analizadores Orbitrap atrapan iones en un campo electrostático y miden sus frecuencias de oscilación, proporcionando alta resolución y precisión de masa. Los analizadores de trampa de iones confinan los iones en un campo eléctrico tridimensional y los expulsan secuencialmente. Los instrumentos híbridos que combinan múltiples tipos de analizadores, como cuadrupolo-Orbitrap o instrumentos de triple cuadrupolo, proporcionan flexibilidad para diferentes estrategias experimentales.

Proteómica de Abajo Arriba

La proteómica de abajo arriba analiza proteínas (a menudo separadas por SDS-PAGE) después de la digestión en péptidos, típicamente usando tripsina, que corta después de residuos de arginina y lisina. La mezcla de péptidos resultante se separa por cromatografía líquida y se analiza por espectrometría de masas en tándem. En la adquisición dependiente de datos, el espectrómetro de masas selecciona los iones peptídicos más abundantes para su fragmentación mediante disociación inducida por colisión. Los espectros de iones fragmento resultantes se buscan en bases de datos de secuencias de proteínas para identificar los péptidos y sus proteínas parentales.

Espectrometría de Masas en Tándem

En la espectrometría de masas en tándem, un ion precursor de una relación masa-carga específica se selecciona y fragmenta, y se miden las masas de los iones fragmento. La disociación inducida por colisión fragmenta los péptidos principalmente en los enlaces amida, produciendo iones b e y. La diferencia de masa entre iones y adyacentes o iones b adyacentes revela la secuencia de aminoácidos. Los métodos de fragmentación de alta energía como la disociación por transferencia de electrones proporcionan información complementaria, preservando las modificaciones postraduccionales lábiles.

Identificación de Proteínas

La identificación de proteínas a partir de espectros de masas en tándem utiliza motores de búsqueda de bases de datos como Mascot, Sequest o MaxQuant. Las masas de iones fragmento observadas se comparan con espectros teóricos generados a partir de la digestión in silico de secuencias de proteínas en una base de datos. El análisis estadístico determina la confianza de cada identificación. La secuenciación de novo, que deriva la secuencia peptídica directamente del espectro de masas sin una base de datos, se utiliza para organismos con genomas no secuenciados o para identificar péptidos novedosos.

Proteómica Cuantitativa

La proteómica cuantitativa mide cambios en la abundancia de proteínas entre condiciones. Los métodos basados en marcadores introducen isótopos estables que se distinguen por desplazamientos de masa. SILAC incorpora aminoácidos marcados isotópicamente mediante marcaje metabólico en cultivo celular. TMT e iTRAQ utilizan marcadores químicos que liberan iones reporteros durante la fragmentación, permitiendo la cuantificación multiplexada de hasta 16 muestras. La cuantificación sin marcaje compara las intensidades de iones peptídicos o los recuentos espectrales entre corridas, requiriendo una normalización cuidadosa.

Análisis de Modificaciones Postraduccionales

La espectrometría de masas es particularmente adecuada para identificar y localizar modificaciones postraduccionales. La fosforilación se detecta por un aumento de masa característico de 80 Da y una pérdida neutra de ácido fosfórico durante la fragmentación. Los métodos de enriquecimiento como la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados o la cromatografía de dióxido de titanio se utilizan para purificar fosfopéptidos antes del análisis. La glicosilación es más desafiante porque los glicopéptidos se fragmentan pobremente y las estructuras de glicanos son heterogéneas. Los métodos de fragmentación especializados como la disociación por transferencia de electrones preservan los enlaces glicano-péptido, permitiendo el análisis sitio-específico.

Proteómica Clínica

La proteómica clínica aplica tecnologías proteómicas a problemas médicos. El descubrimiento de biomarcadores identifica proteínas cuya abundancia cambia en enfermedades, permitiendo potencialmente el diagnóstico temprano o el monitoreo del tratamiento utilizando técnicas como ELISA. La proteómica de tejidos analiza especímenes clínicos fijados en formalina e incluidos en parafina. La proteómica de plasma enfrenta desafíos debido al enorme rango dinámico de concentraciones de proteínas, constituyendo la albúmina por sí sola más de la mitad de las proteínas totales. La depleción por afinidad de proteínas abundantes y la fraccionación extensa son típicamente necesarias para un análisis profundo del proteoma plasmático.