El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un inmunoensayo en placa utilizado para detectar y cuantificar proteínas, anticuerpos, hormonas y otras moléculas. Combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de la detección basada en enzimas.
Cómo Funciona el ELISA
- Recubrimiento
Se recubre una placa de microtitulación con un antígeno o anticuerpo de captura. La molécula diana se une a la superficie mediante adsorción pasiva. La placa se incuba toda la noche y luego se lava para eliminar el material no unido.
- Bloqueo
Se añade una solución de bloqueo que contiene una proteína irrelevante como BSA o caseína a los pocillos. Esto cubre cualquier sitio de unión restante en la superficie de la placa, evitando la unión inespecífica en pasos posteriores.
- Anticuerpo de Detección
Se añade un anticuerpo de detección conjugado a una enzima—generalmente peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP). En un ELISA sándwich, un anticuerpo primario se une a la diana, y un anticuerpo secundario enlazado a la enzima se une al primario.
- Generación de Señal
Se añade un sustrato para la enzima. La enzima convierte el sustrato en un producto coloreado, fluorescente o luminiscente. La reacción se deja proceder durante un tiempo determinado y luego se detiene.
- Medición
La señal se mide usando un lector de placas. La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de molécula diana en la muestra. Una curva estándar con concentraciones conocidas permite la cuantificación.
- Formatos de ELISA
- ELISA directo: El antígeno se recubre y un anticuerpo enlazado a enzima lo detecta directamente.
- ELISA indirecto: El antígeno se recubre, un anticuerpo primario se une y un anticuerpo secundario enlazado a enzima lo detecta.
- ELISA sándwich: Un anticuerpo de captura se recubre, el antígeno se une y un anticuerpo de detección completa el sándwich.
- ELISA competitivo: La señal disminuye a medida que aumenta la concentración de la diana.
